Molekuláris genetikai és szövettenyésztési módszerekkel előállított növények herbicid- és nehézfém-tűrőképességének, illetve biotikus stresszekkel szembeni ellenállóképességének vizsgálata = Tolerance against herbicides and heavy metals, and resistance to biotic stresses of plants modified by molecular genetic and tissue culture methods

A projekt során megvizsgáltuk nyárfanövények felhasználhatóságát szennyezett talajok megtisztítására (fitoremediációjára). A vizsgálatokhoz egy szürkenyár hibridet, ennek két géntechnológiával módosított klónját, valamint a fekete nyár N-SL klónját alkalmaztuk. A génmódosított klónokat a baktériális eredetű gamma-glutamil-cisztein szintetáz génnel (gshI) transzformálták. Az enzim a növényi tripeptid glutation bioszintézisében játszik szerepet, így a transzformált növények magas glutation tartalommal rendelkeztek. A növények méregtelenítési reakciókban a glutation központi szerepet játszik. In vitro levélkorong kulturákban megvizsgáltuk a klón-stabilitást és a nyárfavonalak fitoremediációs kapacitását. A transzformált növényekbe beépített gshI gén jelenlétét PCR technikával ellenőriztük. Enzimológiai és klorofill fluoreszcencia mérésekkel összehasonlítottuk a transzgenikus és hagyományos nyárfa vonalak stressz-tűrését. A nyárfa növények jó stressz-ellenálló képességgel rendelkeztek acetoklór gyomírtószerrel és egyes nehézfémekkel szemben. A transzgenikus növények stressz-ellenállóképessége általában kis mértékben nagyobb volt, mint a nem-transzformált növényeké. Az erősen toxikus paraquat gyomírtószerrel szemben nem tért el jelentősen a transzgénikus és hagyományos nyárfa vonalak stressz-érzékenysége. A méregtelenítésben szerepet játszó egyes enzimek (aszkorbát-peroxidáz és glutation S-transzferáz) aktivitását jelentősen befolyásolta a nyárfa tápközegének szacharóz tartalma. | The suitability of different poplar varieties for the cleansing of polluted soils (phytoremediation) was studied. A grey poplar hybrid, its two transgenic clones, and the N-SL clone of Populus nigra were used during the investigations. The transgenic plants were transformed by a bacterial gene (gshI), which encodes the gamma-glutamyl-cysteine synthase enzyme. This enzyme participates in the biosynthesis of the endogenous plant tripeptide glutathione, and thus the transgenic plants contained elevated glutathione levels. Glutathione plays a principal role in plant detoxification reactions. The clone stability and the phytoremediation capacity of poplar lines was studied in vitro, in leaf disc cultures. The presence of the gshI transgene was verified by PCR technique. The stress tolerance of transgenic and normal poplar lines was compared by enzymatic analyses and chlorophyll fluorescence measurements. The investigations demonstrated the high stress tolerance of poplar plants against the herbicide acetochlor and heavy metals. Generally, the stress tolerance of transgenic poplars was slightly higher than that of normal poplar lines. The stongly phytotoxic herbicide paraquat caused similar toxic effects in both transgenic and normal poplar tissues. The activities of some enzymes participating in detoxification reactions (ascorbate peroxidase and glutathione S-transferase) were strongly influenced by the sucrose content of the nutrient medium of poplars

Gene up-regulation by DNA demethylation in 35S-gshI-transgenic poplars (Populus x canescens)

Gene expression levels of transgene 35S-gshI (γ-glutamylcysteine synthetase) cloned from E. coli, and the endogenous gene gsh1 of poplar (Populus x canescens) were upregulated by the DNA demethylating agent DHAC (5,6-dihydro-5'-azacytidine hydrochloride) (10-4 M for 7 days) in aseptic leaf discs cultures. Two 35S-gshI-transgenic (6lgl and 11ggs) and wild type (WT) poplar clones were used. The efficiency of gene upregulation was also analyzed under herbicide paraquat stress (4 x 10-7 M). Levels of gshI-mRNA and gsh1-mRNA were determined by RT-qPCR (reverse transcriptase quantitative PCR) after cDNA synthesis. For internal control, the constitutively expressed housekeeping poplar genes α-tubulin and actin were used, and the 2−HHCt method was applied for data analysis. In long term DHAC treatment (21 days), a morphogenetic response of de novo root development was observed on leaf discs in a wide concentration range of DHAC (10-8 to 10-6 M). Adventitious shoots (11ggs clone) also emerged from leaf discs after a combined treatment with DHAC (10-4 M) and paraquat (10-7 M). Shoots were dissected, rooted and transplanted in glass houses for further analyses for phytoremediation capacity. Since DNA methylation patterns are inherited (epigenetic memory), these poplar plants with increased gene expression levels of both transgene 35S-gshI and endogenous gene gsh1 provide novel plant sources for in situ application

A lipoxigenáz izoenzimek és az oxilipinek szerepének vizsgálata bab és dohánynövények betegségellenállóságában = The role of lipoxygenase isoenzymes and oxylipins in disease resistance of bean and tobacco

A lipoxigenáz (LOX) enzimek és az általuk termelt lipid-hidroperoxidokból enzimatikus úton képződő, változatos szerkezetű oxilipinek jelentős szerepet játszanak a vírusfertőzött dohány és paprikanövények védekezési reakcióiban. A vírusfertőzött dohány és paprika levelekben mind a 9- mind a 13-LOX enzimek aktivitása megemelkedik. Az inkompatibilis gazdanövény-kórokozó kapcsolatokban (a rezisztens növényekben) az aktivitás emelkedése gyorsabban és nagyobb mértékben jelentkezik, mint kompatibilis kapcsolatokban. A vírusfertőzött rezisztens paprika levelekben több LOX kódoló gén expressziója erősen megemelkedik. Tömegspektrometriás mérésekkel kimutatható volt, hogy egyes illékony vegyületek, így a 2,4-hexadienal, az alfa-jonon és a pentadekanal mennyisége jelentősen megemelkedett a vírusfertőzés következtében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az oxilipinek mellett terpenoid jellegű vegyületek is felhalmozódnak a vírusfertőzött levelekben. Kimutattuk a divinil-éter szintetáz (DES) gén és egy patatin-szerű lipáz gén szerepét a vírusfertőzött paprikalevelek védekezési reakcióiban. Meghatároztuk a DES gén kódoló régiójának teljes szekvenciáját. Bablevelekben szintén megemelkedett a lipoxigenáz aktivitás a biotróf rozsdagomba Uromyces phaseoli által okozott fertőzés hatására. | Lipoxygenase (LOX) enzymes and oxylipins play important roles in the defense reactions of virus-infected pepper and tobacco plants. Oxylipins are produced from LOX-derived lipid hydroperoxides. In virus infected pepper and tobacco leaves the activities of both 9- and 13-LOX enzymes were significantly elevated. In incompatible plant-virus interactions the increase of LOX activity is much stronger and appears more rapidly than in compatible interactions. In virus infected resistant pepper leaves the expression of several individual LOX coding genes was markedly up-regulated. Mass spectrometric studies showed the accumulation of the volatile 2,4-hexadienal, alpha-ionone and pentadecanal in virus infected resistant pepper leaves. These results showed that beside oxylipins also terpenoid compounds accumulated in pepper leaves following virus infections. We demonstrated the significant role of a divinyl ether synthase (DES) and a patatin-like lipase in virus infected pepper leaves. The entire coding region of DES gene was sequenced. Markedly elevated LOX activities were found also in bean leaves inoculated with the biotrophic rust fungus Uromyces phaseoli

AFLP analysis and improved phytoextraction capacity of transgenic gshI-poplar clones (Populus canescens L.) in vitro

Clone stability and in vitro phytoextraction capacity of vegetative clones of R x canescens (2n = 4x = 38) including two transgenic clones (ggs11 and lgl6) were studied as in vitro leaf disc cultures. Presence of the gshI-transgene in the transformed clones was detected in PCR reactions using gshI-specific primers. Clone stability was determined by fAFLP (fluorescent amplified DNA fragment length polymorphism) analysis. In total, 682 AFLP fragments were identified generated by twelve selective primer pairs after EcoRI-MseI digestion. Four fragments generated by EcoAGT-MseCCC were different (99.4% genetic similarity) which proves an unexpectedly low bud mutation frequency in R x canescens. For the study of phytoextraction capacity leaf discs (8 mm) were exposed to a concentration series of ZnSO4 (10(-1) to 10(-5) m) incubated for 21 days on aseptic tissue culture media WPM containing 1 mu m Cu. Zn2+ caused phytotoxicity only at high concentrations (10(-1) to 10(- 2) m). The transgenic poplar cyt-ECS (ggs11) clone, as stimulated by the presence of Zn, showed elevated heavy metal (Cu) uptake as compared to the non-transformed clone. These results suggest that gshI-transgenic poplars may be suitable for phytoremediation of soils contaminated with zinc and copper

Feketenyár (Populus nigra) gametoklónok mikroszatellita változatossága; (TTCTGG)5 deléció a WPMS-20 lokuszon.

A nyárfajok (Populus ssp) extrém kis méretű genomja (2n=4×=38; 5.5×108 bp; 2C=1.1 pg) nagyfokú genetikai stabilitással párosul. Munkánk célja a feketenyár (Populus nigra) genetikai variabilitásának növelése volt haploid (n) indukció alkalmazásával, portoktenyészetben, két portok-donor klón (N-SL és N-309) alkalmazásával. A felnevelt haploid utódok (1-35) genetikai polimorfizmus elemzését öt SSR lokusz allél diverzitásával jellemeztük. Összesen 20 SSR allél 280 szekvenciáját azonosítottuk, egy-egy lókuszon 1-6 allélgyakorisággal: WPMS-02 (5 allél), WPMS-04 (6 allél), WPMS-06 (2 allél), WPMS-20 (6 allél) és PTR-04 (1 allél). Az elemzést ALF (automatic laser fluorometer) módszerrel végeztük. A WPMS-20 allél szekvencia elemzésével egy 5-szörös (TTCTGG) deléciót mutattunk ki a (TTCTGG)8 lokuszon. Az SSR allélek léte, illetve nemléte alapján dendrogramot készítettünk, amely alapján elemeztük és meghatároztuk az új nemesítésű klónok genetikai diverzitását. Az új SSR-klóntípusok jelentős nemesítési alapanyagot szolgáltatnak a nyárfanemesítés számára

Evaluation of TMV Lesion Formation and Timing of Signal Transduction during Induction of Systemic Acquired Resistance (SAR) in Tobacco with a Computer-Assisted Method

Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi nc plants were inoculated with tobacco mosaic virus (TMV) in order to develop a method for evaluation of lesion size and its distribution characteristics during the induction of systemic acquired resistance (SAR). All necrotic lesions were scored with an image analysis software and subjected to statistical analysis. The diminished lesion size and its right-skewed, non-normal distribution seem to be an important feature of SAR response. The results showed that the degree of induced resistance differs according to the position of the leaf on the plant’s shoot. In order to detect the timing of signal transduction from TMV infected leaves to distant ones, the infected leaves were removed from the tobacco plants at different time intervals. When the infected leaves were removed after 4 days, the SAR was always induced on the distant leaves indicating complete signal transduction within 4 days

Metilviologén (paraquat) toleráns nyárfaklónok (Populus x canescens) szelekciója és alkalmazása fitoremediációban

Paraquat (syn.: metilviologén) toleráns nyárfa (Populus x canescens) klónok szelekcióját végeztük el in vitro kultúrában. A szintetikus talaj összetétele: WPM (Woody Plant Media) tápsók, 1% szacharóz, 0,8 % agar 1 mg/l benziladenin, 0,2 mg/l naftilecetsav és paraquat koncentráció sor (2×10(-6) M, 1,47×10(-6) M, 9,3×10(-7) M, 4×10(-7) M) volt. A regeneránsokat szelekciós táptalajon történő tesztelés után felszaporítottuk (mikroszaporítás), gyökeresítettük, majd üvegházban felneveltük. A molekuláris (RTqPCR) és biokémiai elemzések (aszkorbát peroxidáz, glutation peroxidáz, glutation Stranszferáz, lipoxigenáz) igazolták egy rendkívül stabil paraquat toleráns klón sikeres szelekcióját. A klónokat az in vitro vizsgálatokat követően in situ (Fűzfőgyártelep) teszteljük gyomirtószer maradványok toleranciájára. | Paraquat (syn.: methylviologen) tolerant poplar (P. x canescens) clones (PQT) were selected in in vitro cultures at concentration series of paraquat (2×10(-6) M, 1.47×10(-6) M, 9.3×10(-7) M, 4×10(-7) M). After testing on tissue culture media, regenerants were micropropagated. After rooting, PQT-clones were transplanted to a greenhouse. PQT clones showed significantly higher gst gene expression then wild type (WT) analyzed by RT-qPCR (quantitative reverse transcriptase PCR). For functional analysis enzyme activities of GST (glutathione S-transferase), APOX (ascorbate peroxides), GR (glutathione reductase), and LOX (lipoxygenase, pH 8.0) were determined. After rooting, PQT-clones were transplanted in glass houses, followed by field performance analyses for phytoremediation (environmental clean up using plants) capacity in heavily contaminated area at Balatonfűzfő, Hungar

A gst gén DNS-demetilált overexpressziója a szürkenyár (Populus x canescens) fitoremediációs kapacitásának növelésére

A szürkenyár (Populus x canescens) gst (glutation S-transzferáz) génexpresszióját növeltük meg DHAC-indukált (5,6-dihidro-5'-azacitidin hidroklorid) DNSdemetilációval. Három klónt vizsgáltunk, a természetes (WT) és két glutationtúltermelő 35S-gshI nyárfaklónt (11ggs, 6lgl) RT-qPCR elemzésben. A gst gén megemelt expressziós szintje a DHAC-kezelt kontroll növényekben 4,9-szeresre emelkedett, amely tovább nőtt paraquat stresszben (11,2-szeres), amely eredmény azt bizonyítja, hogy a DNS demetilációjával az endogén gének expressziós szintje nagyságrendekkel emelhető meg. Ismert, hogy a DNS demetiláció a vegetativ klónokban öröklődik (epigenetikus memória), ezért a demetilációs eljárás (gén upreguláció) új lehetőséget ad stressztűrő nyárfaklónok előállítására. | In the study presented gst (glutathione S-transferase) gene expression levels of poplar (Populus x canescens) were analyzed in response to the DNA demethylating agent DHAC (5,6-dihydro-5'-azacytidine hydrochloride). Aseptic leaf discs cultures of wild type (WT) and two gshI-transgenic clones (6lgl and 11ggs) clones were analyzed by RT-qPCR. High expression levels of DHAC treated control plants (4.9-fold increment, and a further 11.2-fold increment after paraquat treatment) proves that DNA demethylation provides powerful tools in gene-upregulation. As DNA methylation patterns are inherited (‘epigenetic memory’) novel poplar plant sources are provided with increased gst gene expression levels

Glutathione S-Transferase Enzymes in Plant-Pathogen Interactions

Plant glutathione S-transferases (GSTs) are ubiquitous and multifunctional enzymes encoded by large gene families. A characteristic feature of GST genes is their high inducibility by a wide range of stress conditions including biotic stress. Early studies on the role of GSTs in plant biotic stress showed that certain GST genes are specifically up-regulated by microbial infections. Later numerous transcriptome-wide investigations proved that distinct groups of GSTs are markedly induced in the early phase of bacterial, fungal and viral infections. Proteomic investigations also confirmed the accumulation of multiple GST proteins in infected plants. Furthermore, functional studies revealed that overexpression or silencing of specific GSTs can markedly modify disease symptoms and also pathogen multiplication rates. However, very limited information is available about the exact metabolic functions of disease-induced GST isoenzymes and about their endogenous substrates. The already recognized roles of GSTs are the detoxification of toxic substances by their conjugation with glutathione, the attenuation of oxidative stress and the participation in hormone transport. Some GSTs display glutathione peroxidase activity and these GSTs can detoxify toxic lipid hydroperoxides that accumulate during infections. GSTs can also possess ligandin functions and participate in the intracellular transport of auxins. Notably, the expression of multiple GSTs is massively activated by salicylic acid and some GST enzymes were demonstrated to be receptor proteins of salicylic acid. Furthermore, induction of GST genes or elevated GST activities have often been observed in plants treated with beneficial microbes (bacteria and fungi) that induce a systemic resistance response (ISR) to subsequent pathogen infections. Further research is needed to reveal the exact metabolic functions of GST isoenzymes in infected plants and to understand their contribution to disease resistance