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Adenoviral infections of neurons, glial cells and ventricle ependyma cells in situ as a prospect for an in-vivo genetic therapeutical approach in neurodegenerative diseases
Deckblatt-Impressum
persönlicher Dank
Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Zusammenfassung
Summary
Literaturverzeichnis
Anhang - Abkürzungsverzeichnis
Vorabveröffentlichungen
Danksagung
SelbständigkeitserklärungIn der hier vorliegenden Arbeit werden unter Verwendung eines adenoviralen
Vektors der dritten Generation, eines sogenannten gutless Vektors, zunächst
die Transduktionseigenschaften sowie die Transduktionseffizienz verschiedener
Stammzellpopulationen untersucht. Zu diesen Zellen gehören sowohl glial
restringierte Vorläuferzellen der Ratte und des Menschen sowie embryonale
Stammzellen der Maus. Stellvertretend für eine adulte Stammzelle wird die
Möglichkeit einer Transduktion der autolog verfügbaren mesenchymalen
Stammzellen aus dem humanen Knochenmarkstroma untersucht. Für die Transduktion
werden Vektoren mit verschiedenen Reportersequenzen eingesetzt, sodass nach
der Infektion der Transduktionserfolg anhand der Transgenexpression ermittelt
werden kann. Zu den Reportergenen gehört einerseits das grün fluoreszierende
Protein (GFP), das LacZ (ß- Galaktosidase) sowie als Markerenzym zur
Darstellung der Syntheserate der transduzierten Zellen, die sezernierte
alkalische Phosphatase des Menschen (SEAP). Unter Verwendung steigender
infektiöser Partikel (10, 50 und 100 MOI) kann in den untersuchten
Zellpopulationen eine dosisabhängige Transduktionsrate ermittelt werden. Dabei
werden die höchsten Transduktionsraten in den glial restringierten neuralen
Vorläuferzellen erzielt. Nach Infektion der neural differenzierten embryonalen
Stammzellen zeigt sich ebenfalls die Tendenz einer bevorzugten Transduktion
von glial differenzierten Zellen. Die Verwendung von adulten Stammzellen
resultiert ebenfalls in Transduktionsraten von bis zu 85%. In einem weiteren
Versuchsabschnitt werden glial restringierte neurale Vorläuferzellen nach
Infektion mit dem adenoviralen Vektor in das Striatum adulter Ratten
injiziert. Dieses Vorgehen soll die Möglichkeit eines ex-vivo
gentherapeutischen Einsatzes in Verbindung mit astrozytären Zellen als
mögliche Trägerzellen näher beleuchten. Die Befunde dieses Teilabschnittes
zeigen, dass sich die transduzierten Zellen im Empfängergewebe integrieren und
innerhalb des Beobachtungszeitraumes von 6 Wochen nur in begrenztem Maße in
das umliegende Gewebe migrieren. Dabei zeigen die Zellen die normalen
Differenzierungscharakteristika entlang der glialen Zelllinie, wie das für
Astrozyten in-vivo beschrieben wurde. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt
sich mit der Möglichkeit der direkten Vektorinjektion in das zentrale
Nervensystem. Dabei wird der adenovirale Drittgenerationsvektor in
verschiedene Hirnareale injiziert. Mittels immunhistochemischen Färbungen für
NeuN und GFAP kann gezeigt werden, dass nach Injektion in das Striatum analog
zur Situation in-vitro eine präferentielle Transduktion von Astrozyten erzielt
wird. Innerhalb dieses Hirnkompartimentes kann eine Diffusion des Vektors bis
zu einer Distanz von 1000 µm von der Injektionsstelle ermittelt werden. Nach
Injektion der Vektorpartikel in das Corpus callosum kommt es zu einer
Verteilung des Vektors innerhalb des gesamten Fasertraktes der weißen
Substanz, einschließlich des kontralateralen Abschnittes. Mit diesen Befunden
wird deutlich, dass die Verteilung des Vektors abhängig von der Struktur und
Beschaffenheit des Empfängergewebes ist. Wird der Vektor in den Liquorraum des
Seitenventrikels injiziert, kann anschließend eine Transgenexpression (GFP
oder LacZ) in den Ependymzellen des gesamten Ventrikels dargestellt werden.
Diese Befunde deuten darauf hin, dass sich der Vektor innerhalb des Liquor
cerebrospinalis verteilt und als Folge eine generalisierte Transduktion der
Ventrikelependymzellen erfolgt. Nach Anlegen einer permanenten Sonde in den
Seitenventrikel kann kontinuierlich Liquor zur Analyse des Markerenzyms SEAP
entnommen werden. Mittels des luminometrischen Nachweisverfahrens kann nach
Vektorinjektion über einen Zeitraum von bis zu 42 Tagen das Enzym SEAP im
Liquor cerebrospinalis nachgewiesen werden. Insgesamt zeigen die Befunde, dass
die Verwendung des adenoviralen Vektors zumindest unter experimentellen
Bedingungen eine zukunftsträchtige Therapieoption für Erkrankungen des
zentralen Nervensystems darstellt.In this study the characteristics of transduction as well as the efficacy of
transduction of different stem cell populations are being investigated by
using a 3rd generation adenoviral vector, a so called gutless adenoviral
vector. These cells include glial restricted precursor cells of rat and human
origin as well as murine embryonic stem cells. As representatives for an adult
stem cell population the possibility of a transduction of the autologous
available mesenchymal stem cells deriving from the human bone marrow stroma
are examined. For cell transduction, vectors with different reporter sequences
are applied, resulting in the possibility of measuring the transduction
success after infection by the transgene expression. The reporter genes
include the green fluorescent protein (GFP), the LacZ (ß-galactosidase) as
well as the human secreted placenta alkaline phosphatase (SEAP). Applying
increasing numbers of infectious particles (10, 50 and 100 MOI) a
concentration-dependent transduction rate can be ascertained in the different
investigated cell populations. The highest transduction rates are achieved in
association with the glial restricted neural precursor cells. Following
infection of the neural differentiated embryonic stem cells similarly a
tendency towards a preferred transduction of glial differentiated cells is
observed. The use of adult stem cells also results in transduction rates up to
85%. In further investigations glial restricted neural precursor cells, after
having been infected with the adenoviral vector are injected into the striatum
of adult rats. This procedure was performed in order to test the possibility
of an ex-vivo gene therapeutical use in association with glial cells as
possible carrier cells. The results show that the transduced cells are
integrated into the receiving tissue and during the investigation period of
six weeks only migrate into the surrounding tissue to a restricted extent. At
a closer look the injected cells show normal characteristics of
differentiation along the glial cell linage as it has been described for
astrocytes in-vivo. The second part of this study focuses on the direct vector
injection into the central nervous system. Therefore the 3rd generation
adenoviral vector is injected into different brain areas. Using
immunohistochemical investigations using antibodies against NeuN and GFAP it
can be shown that after injection into the striatum analogous to the situation
in-vitro a preferential transduction of astrocytes is achieved. Within this
brain compartment a diffusion of the vector up to a distance of 1000 µm from
the injection site can be determined. Following injection of vector particles
into the corpus callosum, a vector distribution within the entire fibre tract
of the white substance including the contralateral hemisphere is observed.
With these results it can be shown that the allocation of the vector is
dependent on the structure and features of the receiving tissue. Injecting the
adenoviral vector into the cerebrospinal fluid results in transgene expression
(GFP, LacZ and SEAP) in the ependymal cells surrounding the entire ventricle.
These results suggest that the vector distributes within the cerebrospinal
fluid and therefore would result in a generalized transduction of ependymal
cells. After installing a permanent catheter in the lateral ventricle
cerebrospinal fluid may be removed in a continuous manner in order to
analyse/evaluate the marker enzyme SEAP. Using a luminometric screening
procedure the enzyme SEAP can be demonstrated up to a period of 42 days
following vector injection into the cerebrospinal fluid. Summarizing the
results, the use of an adenoviral vector at least under experimental
circumstances might be a pioneer therapeutical option for diseases of the
central nervous system
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