USE OF COMBINATION OF FLUORESCENT PROBES TO IDENTIFY SPERM SUBPOPULATIONS FOR QUALITY ASSESSMENT OF FRESH AND CRYOPRESERVED CANINE SEMEN. PRELIMINARY RESULTS

The use of fluorescent markers in the evaluation of sperm morphophysiology allows a better accuracy, compared to the subjective nature of some routine tests in semen qualification. In this study was used the combination of fluorescence probes: propionate iodide, Hoechst 33342 and FITC-PSA in fresh and thawed dog semen, to the identification of the following morphological subpopulations: II (intact plasma and acrosomal membranes), IL (intact plasma membrane and lesioned acrosomal membrane), LI (lesioned plasma membrane and intact acrosomal membrane) and LL (both membranes lesioned). When comparing the results obtained with the results of the tests used conventionally in semen evaluation (sperm motility and vigor, hypoosmotic test and morphological alterations), little correlation was observed. The II population declined from fresh semen to thawed, while LL population increased (p <0.05). The IL population was composed of extremely small numbers of cells but increased (p <0.05) from fresh semen to thawed semen. In the thawed semen the major defects had a positive correlation with the LL population (p <0.01). For the thawed semen, the results of the hypoosmotic test (number of cells that reacted to the medium) correlated positively with population II (p <0.025), that is, different from that observed in fresh semen. Although all tests were able to detect decrease in sperm quality post-thawing (p <0.05). The use of this fluorescent probe association allowed qualification and more accurately quantification of plasma membrane and acrosomal insults mediated by cryopreservation. El uso de marcadores fluorescentes en la evaluación de la morfofisiología espermática permite una mayor precisión, comparada con la naturaleza subjetiva de algunas pruebas de rutina en la valoración del semen. En este estudio se usó la combinación de pruebas fluorescentes: yoduro de propidio; Hoechst 33342 y FITC-PSA en semen fresco y descongelado de perro, para la identificación de las siguientes subpoblaciones morfológicas: II (membranas plasmática y acrosomal intactas), IL (membrana plasmática intacta y membrana acrosomal dañada), LI (membrana plasmática dañada y membrana acrosomal intacta) y LL (ambas membranas dañadas). Cuando se comparan los resultados obtenidos con los resultados de las pruebas usadas convencionalmente en la evaluación seminal (motilidad y vigor espermáticos, prueba hipoosmótica y alteraciones morfológicas), se observó poca correlación. La población II disminuyó desde el semen fresco al descongelado, mientras que la población LL se incrementó (p<0.05). la población IL estuvo compuesta por un número extremadamente pequeño de células, pero incremento (p<0.05) desde el semen fresco al descongelado. En el semen descongelado los defectos mayores tuvieron una correlación positiva con la población LL (p<0.01). En el semen descongelado, los resultados de la prueba hipoosmótica (número de células que reaccionan al medio) se correlacionaron positivamente con la población II (p<0.05). El uso de esta asociación de pruebas fluorescentes permitió la valoración y la cuantificación más precisa de los daños a la membrana plasmática y acrosomal mediados por la criopreservación.

Using fluorescent probes and sperm binding to heterologus oocytes and to periviteline membrane, using chiken (Gallus gallus) eggs, for evaluate fresh and frozen-thawed ocelot (Leopardus pardalis) sperm

Estratégias de conservação ex situ objetivam auxiliar na manutenção de populações geneticamente viáveis, por meio de estratégias de reprodução assistida e criopreservação de materiais genéticos. Objetivou-se a validação do uso de combinação de sondas fluorescentes e do teste de ligação à zona pelúcida de ovócitos heterólogos criopreservados na qualificação de sêmen fresco e descongelados de jaguatiricas. Foram usadas três jaguatiricas mantidas em cativeiro, sendo obtidos ejaculados por meio de eletroejaculação e avaliados por testes clássicos de rotina. Através destes testes (vigor e motilidade espermáticos, hiposmótico e morfologia) observou-se queda (p0,05), houve correlação positiva (r= 0,91; p0.05), there was a positive correlation (r=0.91; p<0.05) between they. Correlation was also observed between bound sperm to periviteline membrane, in fresh and frozen=thawed semen, and bent tail spermatozoa in frozen-thawed semen (r=0.81; p<0.05 and r=-0.86; p<0.05, respectively). There was correlation (r=-0.71; p<0.05) between the proportion of tightly bent tail (major defect) and the bound sperm to periviteline membrane, both in frozen-thawed semen. Although ocelots spermatozoa have bound satisfactorily to periviteline membrane, the small number of sample could not demonstrate correlation with the sperm fertility. However, the device developed for the membrane allowed the upkeep of its stretch during processing and defined an evaluation area. Thus, futures studies, with a larger sample are needed for effective validation of this technique.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Pharmacological collection and cryopreservation of semen from big felines kept in captive and captured in wild using foot snares

Os principais desafios na criopreservação de sêmen de felinos de vida livre são desenvolver ou aprimorar uma metodologia eficiente na captura de indivíduos, desenvolver uma técnica mais prática e eficiente na coleta de sêmen com boa qualidade para criopreservação, e também desenvolver equipamentos de resfriamento e congelamento que sejam portáteis e que dispensem o uso de energia elétrica. Objetivou-se, portanto, por meio do presente trabalho adaptar uma metodologia de coleta farmacológica de sêmen e de um método de criopreservação de sêmen de onças pintadas e onças pardas que sejam viáveis para animais de vida livre, capturados por armadilhas de laço. Foram usadas armadilhas de laço compostas por um sistema catapulta, um sistema de contenção e um sistema de monitoramento, nas quais foram realizadas adaptações para melhor adaptação da técnica a três biomas brasileiros Caatinga, Pantanal e Mata Atlântica. O presente trabalho foi o primeiro a capturar onças pintadas e pardas na Caatinga, sendo que a unidade de avaliação do esforço de captura foi “laços-dia”, ou seja, o número de laços armados ao dia que resultou na captura de um animal. O esforço para captura de onça pintada foi de 30,3, 212,5 e 351 laços-dia/captura para o Pantanal, Caatinga e Mata Atlântica, respectivamente. Possivelmente a baixa taxa de captura na Mata Atlântica se deu pela soma de dois fatores: a baixa densidade populacional e a topografia da região, que limitou a área de captura. O mesmo não foi observado para a onça parda neste bioma, cujo esforço de captura foi de 144 laços-dia/captura, possivelmente devido à maior densidade desta espécie. O sucesso de captura (eventos de captura/dias de campanha) de onça pintada foi semelhante ao obtido por trabalhos que usaram cães farejadores, porém essa metodologia exige a manutenção de uma matilha treinada, além de conferir maior risco de acidentes tanto para o animal, quanto para a equipe. Para o estudo da coleta farmacológica de sêmen três onças pardas (Puma concolor) de cativeiro e onze onças pintadas (Panthera onca), sendo seis mantidas em cativeiro e cinco de vida livre, foram anestesiadas com a associação de Medetomidina (0,08- 0,1 mg/kg) e Ketamina (5 mg/Kg). Passados entre 20 e 40 minutos da indução anestésica a uretra dos animais foi sondada com uma sonda uretral estéril para gatos, por onde foi possível coletar ejaculado em todos os animais. Por meio desta técnica coletou-se em média 106,7 μL de sêmen nas onças pardas contendo 524,1 x 106 /mL e 347,2 μL nas onças pintadas contendo 2635,2 x 106 espermatozoides / mL. As avaliações de vigor, motilidade e patologia espermática demonstraram que a técnica não afeta a qualidade do sêmen em relação às demais metodologias usadas em felinos. Para o congelamento do sêmen foram utilizados animais mantidos em cativeiro (seis onças pintadas e três onças pardas). A etapa de resfriamento foi dividida em dois tratamentos, um com a metodologia convencional como uso de gelo e água (Resfriamento A) e a outra com material refrigerante reciclável congelado em nitrogênio líquido (Resfriamento B). Os resultados das avaliações de rotina (vigor, motilidade e teste hiposmótico), com sondas fluorescentes e de análise computadorizada do sêmen demonstraram que não houve diferença entre os dois tratamentos testados. Por meio do presente estudo foi possível desenvolver metodologias que viabilizaram a criopreservação de sêmen de onças pintadas e onças pardas de vida livre. Portanto, o uso de armadilhas de laço associada à coleta farmacológica de sêmen por cateterização uretral, com medetomidina, e resfriamento usando gelo reciclável congelado em nitrogênio líquido mostrou-se eficiente e seguro nas atividades propostas.The major challenges for developing assisted reproduction technologies in wild felines consist on:improve or even develop capture methodologies that are more practical and more efficient; develop new methodologies to collect great quality freezable semen; and develop portable freezing devices that can be used without electric energy. We aimed to adapt a pharmacological method for semen collection and a cryopreservation method that are more efficient for wild animals, captured through a foot snare trap. We used foot snare trap made with a catapult system, a restrain system and a tracking system, in which some adaptations were made for matching the technique to three biomes Caatinga, Pantanal and Atlantic Forest. This is the first jaguar and cougar capture report at Caatinga. The jaguar capture rate was 30.3, 212.5 and 351snare-day/capture at Pantanal, Caatinga and Atlantic Forest, respectively. Possibly the low capture rate at Atlantic Forest was related to two factors: the low population density and the topography, which limited the capture area. However it was not observed for pumas at the same biome, whose capture rate was 144 snare-day/capture, possibly due to the higher density of this specie. The capture success (capture events/ expedition days) was similar to studies that used trailing hounds, however this method requires the maintenance of a trained pack, and confer increased risk for the animal and researchers. To study the pharmacological method for semen collection, three captive cougars and six captive and five wild jaguars were chemically restrained with a combination of medetomidine (0.08 to 0.1 mg/Kg) and Ketamine (5 mg/Kg). After the medetomidine administration – 20 to 40 minutes – the urethra was catheterized using a urinary tomcat catheter, through we could collect semen from all animals. Using this technique we could collect an average of 106.7 μL containing 524.1 sperm/mL from the cougars and 347.2 μL containing 2635.2 sperm/mL from the jaguars. The sperm motility, sperm progressive motility and sperm morphology analysis demonstrated that the methodology don`t affect the sperm quality comparing with other technologies used in felines. To study the cryopreservation protocol we used only captive animals (six jaguars and three cougars). The cooling step was divided into two treatments, one using a standardized method with ice and water (Cooling A) and the other one using a recyclable ice frozen in liquid nitrogen (Cooling B). All results from the routine analysis (sperm motility, sperm progressive motility, sperm morphology), the fluorescent probes and the computerized sperm analysis demonstrated that there was no difference between both treatments. Through this thesis it was possible to develop methodologies that make viable the semen cryopreservation from wild jaguars and cougars. For this purpose it is recommended the foot snare trap to capture the animals; in combination with the semen collection via urethral catheterization using a pharmacological method and the cryopreservation protocol using a recyclable ice frozen in liquid nitrogen at the cooling step.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Comparação entre duas concentrações de glicerol para a criopreservação de sêmen de suçuarana (Puma concolor) Comparison between two glycerol concentrations to cryopreservation of semen of mountain lions (Puma concolor)

O desenvolvimento de biotécnicas de reprodução é uma importante ferramenta para a conservação de animais silvestres ameaçados de extinção. Procedimentos de reprodução assistida em suçuarana, no entanto, são escassos na literatura, em especial aqueles relacionados à criopreservação de sêmen. Neste sentido, o presente trabalho objetivou avaliar a congelabilidade do sêmen de suçuaranas adultas mantidas em cativeiro, por meio da comparação entre duas concentrações de glicerol no meio de congelamento. Foram usados cinco machos adultos de suçuarana, mantidos no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do Mato Grosso do Sul (CRAS/MS). As amostras foram coletadas por eletroejaculação e avaliadas quanto ao seu aspecto físico, volume, vigor, motilidade, concentração e índice espermático. De cada ejaculado duas alíquotas foram diluídas em meio Tris-citrato-gema de ovo, em concentrações finais de 5 e 7,5% de glicerol, resfriadas a uma taxa de -0,55ºC/min e congeladas a uma taxa de -5,8ºC/min. Depois de descongeladas, as amostras foram reavaliadas e submetidas aos testes de termorresistência e hiposmótico. O protocolo de criopreservação e descongelamento de sêmen proposto se mostrou eficiente em ambas as concentrações de glicerol testadas, não havendo diferença (p>0,05) entre estas.<br>The development of biotechnologies of reproduction is an important tool for the conservation of wild animals threatened with extinction. Assisted reproduction procedures in mountain lions, however, are scarce, especially those related to sperm cryopreservation. In this context, this study aimed to evaluate the freezing capacity of semen from adult mountain lions in captivity through the comparison of two concentrations of glycerol in the freezing media. Five adult male mountain lions were used, held at the Rehabilitation Center for Wild Animals of Mato Grosso do Sul (CRAS/MS). Samples were collected by electroejaculation and evaluated for physical appearance, volume, sperm progressive status, sperm motility, sperm concentration and sperm motility index. Each ejaculate was spliced into two aliquots and diluted in Tris-citrate-half egg yolk, at final concentrations of 5 and 7.5% glycerol, cooled at a rate of -0.55ºC/min and frozen at a rate of -5.8ºC/min. Once thawed, the samples were re-evaluated and tested for thermoresistance and hypoosmotic swelling. The suggested protocol for cryopreservation and thawing of semen is efficient in both glycerol concentrations tested, with no difference (p>0.05) between them

Comparação entre duas concentrações de glicerol para a criopreservação de sêmen de suçuarana (Puma concolor)

O desenvolvimento de biotécnicas de reprodução é uma importante ferramenta para a conservação de animais silvestres ameaçados de extinção. Procedimentos de reprodução assistida em suçuarana, no entanto, são escassos na literatura, em especial aqueles relacionados à criopreservação de sêmen. Neste sentido, o presente trabalho objetivou avaliar a congelabilidade do sêmen de suçuaranas adultas mantidas em cativeiro, por meio da comparação entre duas concentrações de glicerol no meio de congelamento. Foram usados cinco machos adultos de suçuarana, mantidos no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do Mato Grosso do Sul (CRAS/MS). As amostras foram coletadas por eletroejaculação e avaliadas quanto ao seu aspecto físico, volume, vigor, motilidade, concentração e índice espermático. De cada ejaculado duas alíquotas foram diluídas em meio Tris-citrato-gema de ovo, em concentrações finais de 5 e 7,5% de glicerol, resfriadas a uma taxa de -0,55ºC/min e congeladas a uma taxa de -5,8ºC/min. Depois de descongeladas, as amostras foram reavaliadas e submetidas aos testes de termorresistência e hiposmótico. O protocolo de criopreservação e descongelamento de sêmen proposto se mostrou eficiente em ambas as concentrações de glicerol testadas, não havendo diferença (p>0,05) entre estas

Comparison of semen samples collected from wild and captive jaguars (Panthera onca) by urethral catheterization after pharmacological induction

This study was designed to evaluate the efficiency of medetomidine anesthesia for semen collection through urethral catheter in wild and captive jaguars. Six captive and five wild jaguars were chemically restrained with a combination of medetomidine (0.08–0.1 mg/kg) and ketamine (5 mg/kg). After medetomidine administration the urethra was catheterized using a urinary tomcat catheter (1 mm diameter × 130 mm length) to collect semen from all animals. By using this technique, we could collect an average of 347.2 μl of semen containing 2,635.2 sperm/ml. Forward progressive motility, sperm progressive motility, and sperm morphology analysis demonstrated that the methodology did not affect sperm quality. Thus, urethral catheterization after medetomidine administration is a practical and efficient method to collect high-quality semen from wild and captive jaguars; this will enable the development of reproductive assisted technologies for jaguars

Ocelot and oncilla spermatozoa can bind hen egg perivitelline membranes

We evaluated the capacity of ocelot and oncilla spermatozoa to bind to the perivitelline membranes (PVMs) of hen eggs in a sperm binding assay (S-PVM). In addition, a device that improves the standardization of the assay was developed. The number of sperm bound to the PVM in fresh (T1) and frozen–thawed (T2) semen from both species was compared to the sperm quality observed in routine tests. The PVM was stretched on a circular silicone device to create a standardized area for analysis. In both treatments and for both species, the spermatozoa were able to bind to the PVM, indicating that PVM may be used for a sperm binding assay in ocelot and oncilla. The S-PVM assay did not differ in fresh and frozen–thawed ocelot sperm (p > 0.05). However, fewer oncilla sperm (p < 0.05) were bound to the PVM in T2, indicating that the proposed test may be able to detect injuries that compromise sperm binding abilities. The device maintained the PVM stretched during the processing and defined the evaluation area