Unión de variantes de la Apolipoproteína A-I a ligandos celulares induciendo amiloidosis

La apolipoproteína A-I (ApoA-I) es un componente mayoritario de las lipoproteínas de alta densidad humanas (HDL), cuyos niveles elevados se correlacionan negativamente con el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares. Un extenso campo de investigación atribuye la alta eficiencia de la ApoA-I a su participación en numerosas vías metabólicas que promueven el transporte reverso de colesterol y la protección de la función endotelial. A pesar de ello diferentes variantes naturales de la ApoA-I presentan una mutación puntual en la secuencia proteica (ya sea sustitución ó deleción), y se encuentran presentes en depósitos patológicos de amiloide. Al momento fueron descriptas más de 50 variantes naturales de esta proteína, de las cuales más de un tercio son asociadas con amiloidosis familiar. Un número importante de estas mutaciones se identifican en la región N-terminal (residuos 26-100) y su cuadro clínico se asocia principalmente con daño renal y hepático. Desde la descripción temprana de las diferentes variantes naturales, se ha investigado para arrojar luz sobre los eventos que determinan su depósito y el concomitante daño orgánico resultante. En este trabajo estudiamos y comparamos el efecto que la mutación pueda inducir en dos variantes naturales N-terminales de ApoA-I: la mutante surgida de una sustitución de Triptófano por Arginina en posición 50 (W50R, descripta en lesiones glomerulares renales), y la resultante del reemplazo de una Leucina en la posición 60 por una Arginina (L60R), la cual se encuentra involucrada en la formación de depósitos amiloides túbulo intersticiales. Los estudios involucraron una exhaustiva caracterización biofísica de la estructura de ambas variantes comparadas a la proteína con la secuencia nativa (Wt). Análisis de dicroísmo circular, fluorescencia y microscopía permitieron definir que a pesar de involucrar mutaciones de similar naturaleza química (reemplazo de un amino ácido no polar por uno positivo en el extremo N), la perturbación estructural que ocurre en W50R es sutil. En cambio, L60R adquiere una conformación más inestable, con pérdida de estructura secundaria y con mayor tendencia a la agregación. Más aún y quizá como consecuencia de lo anterior, esta variante es más susceptible a ser proteolizada, lo que pueda implicar un catabolismo incrementado ó la posibilidad de liberación de algún péptido que pueda per se poseer mayor tendencia a la agregación que la proteína con la secuencia completa. A continuación nos propusimos considerar el efecto de las modificaciones estructurales observadas en la interacción que pueda sufrir la ApoA-I con ligandos naturales. La alta flexibilidad estructural de esta proteína le permite interactuar con membranas biológicas adaptando su conformación, desde estructuras libre de lípidos hasta otras lipidadas, formando parte de las lipoproteínas de alta densidad humana (HDL). La utilización de un modelo de lípido negativo (dodecil sulfato de sodio) nos permitió evidenciar que incluso la proteína Wt podría dar lugar a conformaciones pro-amiloidogénicas ante compuestos o metabolitos circulantes. Más aún, es conocido que distintos cambios de situaciones fisio-patológicas podrían modificar la interacción con el microambiente. Así, analizamos el efecto de un ligero descenso de pH (como puede ocurrir en eventos pro-inflamatorios) sobre la interacción de las variantes con componentes de la matriz extracelular. Es sabido que los proteoglicanos (y sus glucosamino glicanos (GAGs) asociados, podrían favorecer la retención y/o agregación de proteínas. Usando como modelo de GAG a la heparina, pudimos determinar que ante un descenso de pH se incrementa la retención relativa de la variante W50R como compuesto pro-amiloide. Dada la riqueza de GAGs con alta carga negativa en los glomérulos, es importante sugerir que la razón de la presencia de esta variante en la corteza renal pueda deberse a su mayor retención local. Por último nos propusimos evaluar la hipótesis que los cambios conformacionales observados puedan resultar en una estructura que pueda generar el reconocimiento del sistema inmune innato despertando una respuesta pro-inflamatoria. Demostramos que en las condiciones experimentales ensayadas, L60R (pero no W50R) activa un modelo de macrófagos humanos, los cuales liberan el factor de necrosis tumoral α y la interleuquina-1β. Esta observación podría implicar que la generación de una respuesta pro inflamatoria podría incrementar y/o perpetuar la lesión. Como conclusión, los resultados mostrados en este trabajo permiten determinar que los eventos involucrados en la agregación patológica de variantes N terminales de la ApoA-I no son universales a pesar de ser las mutaciones de naturaleza química similar. Mientras que modificaciones leves en la estructura de la variante W50R modificarían su unión (y probable retención) con probables ligandos fisiológicos, la variante L60R experimenta alteraciones conformacionales que incrementan su agregación, grado de proteólisis y disparan la respuesta inflamatoria en un modelo de macrófagos humanos. Estos resultados sugieren fuertemente que la enfermedad crónica puede ser la consecuencia de una pérdida de estructura nativa de las proteínas, lo que rinde conformaciones que pueden ser citotóxicas o precursores de complejos amiloides. Sientan a su vez la base para futuras líneas de investigación que permitan establecer la génesis de la amiloidosis debida a ApoA-I y la órgano especificidad.Facultad de Ciencias Médica

Data regarding the sensibility to proteolysis of a natural apolipoprotein A-I mutant

The article shows dataset of the proteolysis of a natural variant of apolipoprotein A-I (apoA-I) with a substitution of a leucine by and arginine in position 60 (L60R), in comparison with the protein with the native sequence (Wt). This information demonstrates the potential of in vitro partial proteolysis experiments as it may be applicable to different approaches in the biophysical field. We have analyzed by different electrophoresis techniques apoA-I variants, quantified the degree of proteolysis after staining and compared the proteolysis efficiency with the computed cleavage patterns. The data shown here clearly strengthen the usefulness of this approach to test protein flexibility, as it may be attained with enzymes which are not expected to modify in vivo this protein but have a well-known digestion pattern. In addition it is appropriate for evaluating protein catabolism, as it is exemplified here by the evidence with metalloproteinase 12 (MMP-12), which is a physiological protease that may elicit the pro-inflammatory processing of this variant within the lesions. We support the work “Structural analysis of a natural apolipoprotein A-I variant (L60R) associated with amyloidosis” (Gaddi, et al., 2020), gaining insights on protein folding from a characterization by proteolysis analysis [1].Fil: Gaddi, Gisela Marina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Gisonno, Romina Antonela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Rosu, Silvana Antonia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Cortez, María Fernanda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Finarelli, Gabriela Sandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Ramella, Nahuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Tricerri, Maria Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentin

Especies intermedias en la agregación de la apoliproteína A-I: probable rol en la amiloidosis

Las amiloidosis son patologías crónicas, en las que proteínas mal plegadas inducen citotoxicidad de distinta severidad y en distintos órganos. Si bien gran cantidad de bibliografía sugiere que agregados fibrilares maduros serían la especie con mayor patogenicidad, estudios más recientes indican que oligómeros o protofibras podrían jugar un rol fundamental en la cascada de eventos involucrados en la amiloidosis. La amiloidosis inducida por mutantes naturales de la apolipoproteína A-I humana (apoA-I) se presenta con diversas manifestaciones clínicas dependiendo de la variante proteica que se encuentra involucrada. En estudios previos determinamos que distintas variantes de esta proteína poseen aumentada tendencia a agregarse, y que parámetros pro-inflamatorios del micro ambiente favorecen un procesamiento patogénico. En este trabajo extendemos nuestros estudios, y nos planteamos resolver la hipótesis de que distintas especies de agregación intermedia participan en procesos citotóxicos mediados por variantes de apoA-I.Facultad de Ciencias Médica

Especies intermedias en la agregación de la apoliproteína A-I: probable rol en la amiloidosis

Las amiloidosis son patologías crónicas, en las que proteínas mal plegadas inducen citotoxicidad de distinta severidad y en distintos órganos. Si bien gran cantidad de bibliografía sugiere que agregados fibrilares maduros serían la especie con mayor patogenicidad, estudios más recientes indican que oligómeros o protofibras podrían jugar un rol fundamental en la cascada de eventos involucrados en la amiloidosis. La amiloidosis inducida por mutantes naturales de la apolipoproteína A-I humana (apoA-I) se presenta con diversas manifestaciones clínicas dependiendo de la variante proteica que se encuentra involucrada. En estudios previos determinamos que distintas variantes de esta proteína poseen aumentada tendencia a agregarse, y que parámetros pro-inflamatorios del micro ambiente favorecen un procesamiento patogénico. En este trabajo extendemos nuestros estudios, y nos planteamos resolver la hipótesis de que distintas especies de agregación intermedia participan en procesos citotóxicos mediados por variantes de apoA-I.Facultad de Ciencias Médica

Especies intermedias en la agregación de la apoliproteína A-I: probable rol en la amiloidosis

Las amiloidosis son patologías crónicas, en las que proteínas mal plegadas inducen citotoxicidad de distinta severidad y en distintos órganos. Si bien gran cantidad de bibliografía sugiere que agregados fibrilares maduros serían la especie con mayor patogenicidad, estudios más recientes indican que oligómeros o protofibras podrían jugar un rol fundamental en la cascada de eventos involucrados en la amiloidosis. La amiloidosis inducida por mutantes naturales de la apolipoproteína A-I humana (apoA-I) se presenta con diversas manifestaciones clínicas dependiendo de la variante proteica que se encuentra involucrada. En estudios previos determinamos que distintas variantes de esta proteína poseen aumentada tendencia a agregarse, y que parámetros pro-inflamatorios del micro ambiente favorecen un procesamiento patogénico. En este trabajo extendemos nuestros estudios, y nos planteamos resolver la hipótesis de que distintas especies de agregación intermedia participan en procesos citotóxicos mediados por variantes de apoA-I.Facultad de Ciencias Médica

Thiabendazole adsorption on montmorillonite, octadecyltrimethylammonium- and Acremonium sp.-loaded products and their copper complexes

This study is a preliminary approach to develop novel montmorillonite (Mt) based adsorbents for removing inorganic and organic contaminants in a step-like process. Biomass (fungi) and surfactant (octadecyltrimethylammonium bromide) modified montmorillonites (BMt and OMt, respectively) were obtained. In a prior step, Cu2+ was loaded into Mt, BMt and OMt. In a second step, the materials (Mt, Mt-Cu, BMt, BMt-Cu, OMt, OMt-Cu) were used as thiabendazole (TBZ) adsorbents. TBZ adsorption isotherms were performed, and Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich mathematical models were evaluated. TBZ removal efficiency of the materials was also tested using three adsorbent dosages. The adsorbents and TBZ-adsorbed products were characterized by X-ray diffraction and thermal analysis, and by electron paramagnetic resonance (EPR) and solid-state nuclear magnetic resonance measurements (ss-NMR). To determine the subsequent arrangement of the adsorption products, leaching experiments were also conducted. In the BMt sample, TBZ adsorption was enhanced compared to the raw Mt sample. An opposite behaviour was observed for OMt samples. All the Cu2+-loaded materials showed better TBZ removal efficiencies than the same materials without Cu2+. Furthermore, Cu2+ chelation through the imidazolic and thiazolic nitrogen atoms of TBZ in all Cu2+-loaded samples allowed TBZ and Cu2+ to be resistant to migration in environmental leaching conditions.Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámic

Mutaciones en el extremo n-terminal de la apolipoproteína A-I y su efecto en la tendencia amiloidogénica

Amiloidosis es un grupo heterogéneo de enfermedades causadas por el plegamiento anómalo de diversas proteínas que trae en consecuencia un entorno pro inflamatorio con un descenso de pH local. Existen numerosas variantes naturales de Apolipoproteina A-I (Wt) causantes de la enfermedad como las mutaciones Leu60Arg (L60R) y Trp50Arg (W50R) que inducen depósitos proteicos renales. Estudios previos con otras variantes Iowa (Gly26Arg)1, Lys 107-01 y Arg173Pro2 sugieren que la inestabilidad estructural y la tendencia a la agregación podrían ser causantes de esta patología. En el presente trabajo se estudió comparativamente la estabilidad, tendencia a la agregación y susceptibilidad a la proteólisis de Wt, L60R y W50R.Facultad de Ciencias Médica

Mecanismos moleculares que determinan el rol pro amiloidogénico de la apolipoproteína A-I

Las amiloidosis son patologías crónicas, en las que proteínas mal plegadas inducen citotoxicidad de distinta severidad y en distintos órganos. La amiloidosis inducida por mutantes naturales de la apolipoproteína A-I humana (apoA-I) se presenta con diversas manifestaciones clínicas dependiendo de la variante proteica que se encuentra involucrada1. En estudios previos determinamos que la conformación proteica puede sufrir alteraciones estructurales inducidas por parámetros pro-inflamatorios del micro ambiente que favorecen un procesamiento patogénico.Facultad de Ciencias Médica

N-terminal mutants of human apolipoprotein A-I : Structural perturbations associated to protein misfolding

Since the early description of different human apolipoprotein A-I variants associated to amyloidosis, the reason that determines its deposition inducing organ failure has been under research. To shed light into the events associated to protein aggregation, we studied the effect of the structural perturbations induced by the replacement of a Leucine in position 60 by an Arginine as it occurs in the natural amyloidogenic variant (L60R). Circular dichroism, intrinsic fluorescence measurements and assays of binding to ligands indicate that L60R is more unstable, more sensitive to proteolysis and interacts with sodium dodecyl sulfate (a model of negative lipids) more than the protein with the native sequence and other natural variant tested, involving a replacement of a Trytophan by and Arginine in the amino acid 50 (W50R). In addition, the small structural rearrangement observed under physiological pH leads to the release of tumor necrosis factor α and interleukin-lβ from a model of macrophages. Our results strongly suggest that the chronic disease may be a consequence of the loss in the native conformation which alters the equilibrium among native and cytotoxic proteins conformation.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La PlataFacultad de Ciencias MédicasInstituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicada

Thiabendazole adsorption on montmorillonite, octadecyltrimethylammonium- and Acremonium sp.-loaded products and their copper complexes

This study is a preliminary approach to develop novel montmorillonite (Mt) based adsorbents for removing inorganic and organic contaminants in a step-like process. Biomass (fungi) and surfactant (octadecyltrimethylammonium bromide) modified montmorillonites (BMt and OMt, respectively) were obtained. In a prior step, Cu2+ was loaded into Mt, BMt and OMt. In a second step, the materials (Mt, Mt-Cu, BMt, BMt-Cu, OMt, OMt-Cu) were used as thiabendazole (TBZ) adsorbents. TBZ adsorption isotherms were performed, and Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich mathematical models were evaluated. TBZ removal efficiency of the materials was also tested using three adsorbent dosages. The adsorbents and TBZ-adsorbed products were characterized by X-ray diffraction and thermal analysis, and by electron paramagnetic resonance (EPR) and solid-state nuclear magnetic resonance measurements (ss-NMR). To determine the subsequent arrangement of the adsorption products, leaching experiments were also conducted. In the BMt sample, TBZ adsorption was enhanced compared to the raw Mt sample. An opposite behaviour was observed for OMt samples. All the Cu2+-loaded materials showed better TBZ removal efficiencies than the same materials without Cu2+. Furthermore, Cu2+ chelation through the imidazolic and thiazolic nitrogen atoms of TBZ in all Cu2+-loaded samples allowed TBZ and Cu2+ to be resistant to migration in environmental leaching conditions.Fil: Gamba, Martina. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica; ArgentinaFil: Olivelli, Melisa Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología; ArgentinaFil: Lazaro Martinez, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Gaddi, Gisela Marina. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica; ArgentinaFil: Curutchet, Gustavo Andres. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología; ArgentinaFil: Torres Sanchez, Rosa Maria. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Tecnología de Recursos Minerales y Cerámica; Argentin