The role of neurosteroids on Amyloid beta toxcitiy in neuronal cell lines

Giriş: Alzheimer Hastalığı (AH) progresif ilerleme gösteren, hafıza kaybı ile sonuçlanan geri dönüşümsüz nörodejeneratif bir hastalıktır. 65 yaş üzerinde gözlenen demansın en sık nedeni olan AH batı ülkelerinde ölüm nedenleri arasında dördüncü sırada yer almaktadır. Patogenezinde nörofibriller yumak oluşumu, inflamasyon, glutamat toksisitesi, oksidatif stres, sinaptik hasar ve kolinerjik aktivite kaybı gibi bir çok patofizyolofik süreç yer almakla birlikte nöronal dokuda oluşan amiloid beta (Aß) toksisitesinin temel mekanizma olduğuna dair artan görüşler mevcuttur. Aß'nın indüklediği toksisitenin oluşum mekanizması ise henüz kesin olarak bilinmemektir. Beyinde ya da sinir sisteminde sentezlenen, alışılmışın dışında orjinleri ve farklı fonksiyonları nedeniyle nörosteroidler olarak isimlendirilen nöroaktif steroid hormonların nöronal dokudaki sentezi Aß peptidi de içeren pek çok farklı etken tarafından indüklenebilir. Bu nörosteroidler nöronal dokuda doza ve zamana bağlı koruyucu ya da toksik etkiler gösterirler. Ancak Aß toksisitesi ile steroid sentezi arasındaki ilişki henüz açıklığa kavuşmamıştır. Amaç: Bu tez çalışması ile iki farklı sinir hücre hattında oluşturulan Aß toksisitesinin nörosteroid sentezi üzerine etkisi ve steroid sentezinin farklı basamaklardaki inhibisyonunun nöronal hücre canlılığı üzerine etkilerini belirlemek amaçlanmıştır. Bunun yanı sıra nöronal steroidlerin en belli başlılarından olan pregnenolon (P) ve pregnenolon sülfatın (PS) nöronal hücre canlılığı üzerine etkilerini konsantrasyon ve zaman bağımlı olarak değerlendirmek amaçlanmıştır. Materyal ve Yöntemler: Çalışmamızda sıçan feokromasitoma (PC-12) ve insan nöroblastoma (SHSY-5Y) hücre hatları kullanılarak 20/40µM Aß25-35 peptidi ile 72.saatin sonunda oluşturulan anlamlı toksisite sonrası hücre içi P ve PS düzeylerindeki değişim ELISA ve HPLC yöntemleriyle belirlendi. Bu iki steroidin nM-µM'lık değişik konsantrasyonlarının nöronal hücre canlılıklarına ve Aß toksisitesi üzerine etkileri MTT indirgenme, laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı, akış sitometri yöntemleri ve mikroskobik inceleme ile değerlendirildi. Ayrıca aminoglutetimid (AMG) ve 2,4-dikloro-6-nitrofenol (DCNP) kullanılarak steroid sentezi iki farklı basamakta bloke edildikten sonra nöronal hücre canlılıkları üzerine etkileri değerlendirildi. Bulgular: PC-12 hücrelerine 20µM, SHSY-5Y hücrelerine agrege 40µM Aß25-35 peptidi uygulamasının hücre canlılıklarını MTT redüksiyonu ile değerlendirildiğinde 48. ve 72. saatlerin sonunda kontrole göre anlamlı azalttığı gözlendi (p P ve PS'nin suprafizyolojik (>1 µM) konsantrasyonlarda dışarıdan verilmesinin her iki nöronal hücre hattında hücre canlılıklarını anlamlı azalttığı, bunun yanında fizyolojik konsantrasyonlarda ( Steroid sentezinin AMG ve DCNP ile farklı basamaklarda bloke edilmesinin, her iki hücre hattında 72. saatin sonunda hücre canlılıklarında Aß uygulanan gruba kıyasla istatistiksel olarak anlamlı artışa neden olduğu gösterildi (p Sonuç: Sonuç olarak çalışmamızda Aß'nın P sentezi üzerine etkili olduğu ve oluşan P ‘nin sülfotransferaz yoluna gidişinin kısıtlı olduğu gösterilmiştir. Ayrıca P ve PS sentezinin inhibisyonunun ve düşük doz P uygulamasının Aß toksisitesine karşı nöroprotektif etkili olduğunun gösterilmesi Aß‘a bağlı nörodejeneratif değişiklerin önlenmesi ve nörodejeneratif hastalıkların oluşum mekanizmalarının anlaşılmasında önemli ip uçları oluşturacaktır. Anahtar Kelimeler: Pregnenolon, pregnenolon sülfat, amiloid beta, Alzheimer Hastalığı, nörosteroid, nöronal hücre canlılığı Introduction: Alzheimer's disease (AD) is an irreversible, progressive neurodegenarative disorder, which results in memory impairment. AD, the most common cause of dementia among people age 65 and older, takes place in fourth range among the causes of deaths in Western Countries. Many pathophysiological processes play role in its pathogenesis, such as neurofibrillary tangle, inflamation, glutamate toxicitiy, oksidative stress, synaptic damage and lost of cholinergic activity and also some remaining considerations exist about amyloid beta (Aß) toxicity in neural tissue is the basic mechanism. The mechanism of Aß induced toxicity has not known exactly yet. Neuroactive steroid hormones which are biosynthesized in brain or nervous system, are called ‘neurosteroids' since their extraordinary origins and different functions, their synthesis in neural tissue is able to be induced by many different factors that are consist of Aß peptide. These steroids show dose- or time-dependent protective or toxic effects. However, the relation between Aß toxicity and steroid synthesis has not been clearly identified. Purpose: In this thesis study, it is purposed to determine that the effect of Aß toxicity, forming in two different neuron cell lines, on neurosteroid synthesis and the effects of inhibition of neurosteroid synthesis , in different steps, on neural cell viability. Besides, this work aimed to investigate the effects of pregnenolone (P) and pregnenolone sulfate (PS) ,being well-known among neural steroids, on cell viability in a concentration- and exposure time-dependent manner. Materials and Methods: In our study, using rat pheochromocytoma (PC-12) and human neuroblastoma (SHSY-5Y) cell lines, after the significant toxicity formed in the end of 72 hour with 20/40 µM Aß25-35 peptide, the change in intracellular P and PS levels were determined by ELISA and HPLC methods. The effects of different concentrations (nM or µM) of these two steroids on neural cell viability and Aß toxicity were evaluated by MTT reduction, lactate dehydrogenase (LDH) release, flow cytometry methods and microscopic investigation. Moreover, after the inhibition of steroid synthesis in two different steps by using aminoglutethimide (AMG) and 2,4 Dichloro-6-Nitrophenol (DCNP), their effects on neural cell viability were evaluated. Results: When the effect of treatment of PC-12 cells with 20µM and SHSY-5Y cells with 40µM aggregated Aß25-35 peptide on cell viability is evaluated with MTT reduction after 48-72 h exposure a significant decrease is observed compared to control group (p It is determined that external treatment of P and PS in supraphysiological (>1 µM ) concentrations decreased cell viability significantly in both neural cell lines besides in physiological ( It is shown that inhibition of steroid synthesis with AMG and DCNP in two different steps resulted in a statistically significant increase in cell viability in both cell line at 72h exposure compared to Aß-treated group. Conclusion: In conclusion, in our study it is shown that Aß is effective on the synthesis of P and the newly synthesized P participated sulfotransferase pathway in restricted manner. Moreover showing that the inhibition of P and PS synthesis, P exposure in low concentration had neuroprotective effects against Aß toxicity would give important clues to prevent Aß related neurodegenerative changes and to understand the mechanisms of neurodegenerative diseases. Key Words: Pregnenolone, pregnenolone sulfate, amyloid beta, Alzheimer's disease, neurosteroid, neural cell viabilit