Caractérisation fonctionnelle des NTPDASE1, NTPDASE2, NTPDASE8 et de l'ecto-5'-nucléotidase hépatiques

Le foie possède une forte activité d'hydrolyse de l'ATP extracellulaire associée aux canalicules biliaires qui a longtemps été utilisée comme marqueur de cette structure. Jusqu'à récemment, peu d'information était disponible quant à la nature exacte de cette activité. Le clonage d'une nouvelle ectonucléotidase fortement exprimée dans le foie, l'ectonucléoside triphosphate diphosphohydrolase-8 (NTPDase8), suggérait un nouveau candidat potentiel pouvant correspondre à l'ecto-ATPase canaliculaire hépatique. Le premier objectif de mon doctorat était donc de déterminer l'identité moléculaire de la protéine responsable de l'activité ATPasique canaliculaire hépatique. L'ADN complémentaire de la NTPDase8- de rat a été clone et utilisé pour la caractérisation biochimique de l'enzyme recombinante et la production de sera polyclonaux spécifiques. Les activités ATPase et ADPase hépatiques ont été détectées par histochimie enzymatique et l'expression de la NTPDase8 par immunohistochimie. L'activité ATPase majeure de foie de rat a été purifiée, caractérisée biochimiquement et ses propriétés enzymatiques comparées à celles de la NTPDase8 de rat recombinante. Tous les résultats obtenus démontrent que la NTPDase8 correspond à l'ecto-ATPase canaliculaire. Mon deuxième objectif de doctorat était d'étudier l'influence potentielle des NTPDases et de l'ecto-5'-nucléotidase/CD73 sur les concentrations extracellulaires de nucleotides hépatiques, selon leur localisation cellulaire respective. Les différentes ectonucléotidases exprimées à la surface des cellules hépatiques modulent l'activation des récepteurs de nucleosides Pl et/ou de nucleotides P2, en contrôlant les niveaux extracellulaires de leurs agonistes. Dans le foie, les NTPDases sont responsables majoritairement de l'hydrolyse des nucleotides extracellulaires comme l'ATP et l'ADP alors que l'ecto-5'-nucléotidase génère la principale quantité d'adénosine extracellulaire, à pH physiologique. Les activités ATPase, ADPase et AMPase hépatiques ont été détectées par histochimie enzymatique, et l'expression des NTPDasel, 2 et 8, et de l'ecto-5'-nucleotidase par immunofluorescence. L'expression de l'ecto-5'-nucleotidase a été analysée par cytometric de flux sur divers types cellulaires hépatiques primaires. Les profils d'hydrolyse de l'ATP en présence de différentes combinaisons NTPDase/ecto-5'-nucleotidase (reflétant la localisation hépatique de ces enzymes) ont été analysés par HPLC. Nos résultats montrent que les niveaux de nucléo(s/t)ides extracellulaires varient en fonction de la combinaison d'ecto-nucléotidases considérées et de la concentration initiale de substrat ATP extracellulaire

Ticlopidine in Its Prodrug Form Is a Selective Inhibitor of Human NTPDase1

Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (NTPDase1), like other ectonucleotidases, controls extracellular nucleotide levels and consequently their (patho)physiological responses such as in thrombosis, inflammation, and cancer. Selective NTPDase1 inhibitors would therefore be very useful. We previously observed that ticlopidine in its prodrug form, which does not affect P2 receptor activity, inhibited the recombinant form of human NTPDase1 (Ki=14 μM). Here we tested whether ticlopidine can be used as a selective inhibitor of NTPDase1. We confirmed that ticlopidine inhibits NTPDase1 in different forms and in different assays. The ADPase activity of intact HUVEC as well as of COS-7 cells transfected with human NTPDase1 was strongly inhibited by 100 µM ticlopidine, 99 and 86%, respectively. Ticlopidine (100 µM) completely inhibited the ATPase activity of NTPDase1 in situ as shown by enzyme histochemistry with human liver and pancreas sections. Ticlopidine also inhibited the activity of rat and mouse NTPDase1 and of potato apyrase. At 100 µM ticlopidine did not affect the activity of human NTPDase2, NTPDase3, and NTPDase8, nor of NPP1 and NPP3. Weak inhibition (10–20%) of NTPDase3 and -8 was observed at 1 mM ticlopidine. These results show that ticlopidine is a specific inhibitor of NTPDase1 that can be used in enzymatic and histochemistry assays

Liver myofibroblasts of murine origins express mesothelin: Identification of novel rat mesothelin splice variants*

<div><p>Liver myofibroblasts are specialized effector cells that drive hepatic fibrosis, a hallmark process of chronic liver diseases, leading to progressive scar formation and organ failure. Liver myofibroblasts are increasingly recognized as heterogeneous with regards to their origin, phenotype, and functions. For instance, liver myofibroblasts express cell markers that are universally represented such as, ItgαV and Pdgfrβ, or restricted to a given subpopulation such as, Lrat exclusively expressed in hepatic stellate cells, and Gpm6a in mesothelial cells. To study liver myofibroblasts in vitro, we have previously generated and characterized a SV40-immortalized polyclonal rat activated portal fibroblast cell line called RGF-N2 expressing multiple mesothelin mRNA transcripts. Mesothelin, a cell-surface molecule expressed in normal mesothelial cells and overexpressed in several cancers such as, mesothelioma and cholangiocarcinoma, was recently identified as a key regulator of portal myofibroblast proliferation, and fibrosis progression in the setting of chronic cholestatic liver disease. Here, we identify novel mesothelin splice variants expressed in rat activated portal fibroblasts. RGF-N2 portal fibroblast cDNA was used as template for insertion of hemagglutinin tag consensus sequence into the complete open reading frame of rat mesothelin variant coding sequences by extension PCR. Purified amplicons were subsequently cloned into an expression vector for in vitro translation and transfection in monkey COS7 fibroblasts, before characterization of fusion proteins by immunoblot and immunofluorescence. We show that rat activated portal fibroblasts, hepatic stellate cells, and cholangiocarcinoma cells express wild-type mesothelin and additional splice variants, while mouse activated hepatic stellate cells appear to only express wild-type mesothelin. Notably, rat mesothelin splice variants differ from the wild-type isoform by their protein properties and cellular distribution in transfected COS7 fibroblasts. We conclude that mesothelin is a marker of activated murine liver myofibroblasts. Mesothelin gene expression and regulation may be critical in liver myofibroblasts functions and fibrosis progression.</p></div