Efecto de tripomastigotes de Trypanosoma cruzi C1 atenuados por temperatura a la infección experimental en Mus musculus BALB/c con formas infectivas del parásito

La investigación estuvo orientada a determinar el efecto de los tripomastigotes atenuados por calor de T. cruzi a la infección experimental  en Mus musculus BALB/c con la forma infectiva del parásito; para lo cual, se utilizaron tripomastigotes de T. cruzi cepa C1 y ejemplares de Mus musculus BALB/c “ratón”. Los tripomastigotes se obtuvieron en Medio Grace a partir de epimastigotes mantenidos en un cultivo axénico en medio bifásico (BHI + 10% de sangre / PYLB), los que fueron atenuados por shock térmico a temperaturas de  37; 37,5; 38; 38,5 y 39ºC con tiempos de exposición de 30, 60, 90 y 120 segundos y posteriormente inoculados a 20 ejemplares de Mus musculus BALB/c. A los 30 días de la inoculación, se evidenció la presencia del parásito en tres ratones del grupo experimental y en los 17 ratones restantes la ausencia del parásito. Verificada la efectividad de la atenuación, estos parásitos fueron inoculados a 68 ratones del grupo experimental  (4 ratones/17 casos positivos) con una dosis de 106 parásitos/0.2 mL al 0, 7, 21 día; mientras que al grupo control comprendido por cuatro ratones sólo se suministró una dosis de 0.2 mL de Medio Grace. Después de los 30 días de inoculación con la forma infectiva del parásito, una semana posterior a la última inmunización, se obtuvo un 96% de supervivencia en los ratones del grupo experimental y 25% de supervivencia en los ratones del grupo control; con lo cual se comprobó que los parásitos atenuados a temperaturas de 37; 37,5; 38; 38,5 y 39ºC generan un efecto protector en Mus musculus BALB/c.Palabras clave: Trypanosoma cruzi, tripomastigotes, epimastigotes, cultivo axénico

Eficacia de la Técnica de Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay con antígenos de Excreción-Secreción de Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas

Se estima que aproximadamente 10 millones de personas están infectadas por Trypanosoma cruzi, agente productor de la enfermedad de Chagas en América Latina y más de 15 millones de personas están a riesgo de adquirirla.  El presente trabajo tuvo como finalidad determinar la eficacia de la Técnica de Elisa con la utilización de antígenos de excreción-secreción de tripomastigotes de T. cruzi (TESA) en la detección de anticuerpos específicos. Los tripomastigotas se obtuvieron a partir de epimastigotes de una cepa proveniente Arequipa (Perú), a la cual se le incrementó su biomasa en medio bifásico hasta obtener 1x108  parásitos/mL durante 15 días, luego fueron cultivados en medio Grace y en Medio de Eagle (Minimun Essential Medium) para la obtención de los TESA. Estos fueron enfrentados con sueros controles para determinar la eficacia de un ELISA-indirecto. Se encontró que la sensibilidad fue del 100% y la especificidad del 95%. Se concluye que la Técnica de ELISA puede ser utilizada a gran escala, por la facilidad de evaluar un número elevado de muestras y obtener resultados automatizados que no dependen de la subjetividad del personal para su interpretación.Palabras clave: Enfermedad de Chagas, ELISA, trpomastigotas, Trypanosoma cruz

Evaluation of Western blot technique for detection of antigens of Hymenolepis nana

Este trabajo tuvo como objetivo evaluar la técnica de inmunoelectrotransferencia (Western Blot) para detectar los antígenos específicos de excreción/secreción de Hymenolepis nana en sueros de pacientes con himenolepiosis y con otras helmintiosis confirmadas. Se utilizó a Mesocricetus auratus “hamster” para obtener ejemplares adultos de H. nana. Los antígenos de excreción/secreción fueron obtenidos en el medio MEM (Minimum Essential Medium Eagle), y enfrentados con un grupo de sueros de pacientes con himenolepiosis confirmada para evaluar su calidad inmunológica y con sueros individuales de pacientes con himenolepiosis y con otras helmintiosis confirmadas para detectar mediante la técnica de “Western Blot”, los antígenos específicos de este cestode. El grupo de sueros de pacientes con himenolepiosis confirmada reconoció las bandas antigénicas de 50,1; 42,6; 38,9; 32,9; 26,3; 22,4 y 18,6 kDa; sin embargo, los sueros individuales reconocieron diferente número de bandas, siendo la de 50,1 KDa la que fue reconocida por todos ellos. Los sueros de pacientes con helmintiosis confirmadas no reconocieron la banda de 50,1 kDa; sin embargo, dieron reacción cruzada con algunas de las demás bandas, a excepción de los sueros de pacientes con cisticercosis que no reconocieron a ninguna de las bandas de estos antígenos. Se concluye que el antígeno de excreción/secreción de H. nana de 50,1 kDa es específico de este cestode por ser reconocido por todos los sueros de pacientes con himenolepiosis confirmada y no por sueros de pacientes con otras helmintiosis utilizando la técnica de “Western Blot”.Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay or “Western blot” was evaluated to detect specific excretory/secretory antigens from Hymenolepis nana using sera from patient with hymenolepiosis and other confirmed helminthiosis. Hymenolepis nana adults were obtained from experimentally infected golden hamster, the parasits were cultured in Minimum Essential Medium Eagle to get excretory/secretory antigens which were faced to a pool of sera from patients with confirmed hymenolepiosis to evaluate its immunological quality and with individual sera from patients with hymenolepiosis and other confirmed helminthiosis to detect by mean “Western blot” technique, this parasite specific antigens. The pool of sera from patients with confirmed hymenolepiosis recognized seven antigenic bands; 50,1; 42,6; 38.9; 26,3; 22,4; and 18,6 kDa; however, the individual sera recognized different number of bands being 50,1 kDa band the most recognized by all of them. The sera from patients with confirmed helminthiosis did not recognized 50,1 KDa band; however they gave cross reaction with some of the other bands, except the sera from patients with cysticercosis which did not recognized any of this antigen bands. Consequently 50,1 kDa antigen is specific because is recognized by all the sera from patients with confirmed hymenolepiosis and is not recognized by sera from patients with other helminthiosis using “Western blot” technique

DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS SOMÁTICOS Y DE EXCRECIÓN-SECRECIÓN DE LEISHMANIA PERUVIANA POR ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA UTILIZANDO IGY PRODUCIDOS EN GALLUS GALLUS INMUNIZADOS EXPERIMENTALMENTE

The purpose of this study was to determine the somatic and excretory-secretory antigens by Leishmania peruviana electroblotted using IgY antibodies produced by immunized experimental Gallus gallus. Antigens were obtained by centrifugation of promastigotes grown at 37 °C for 20 h in Minimun Essential Medium-Eagle (MEM-Sigma), the supernatant containing the excretory secretory antigens and somatic antigens sediment. For the anti-leishmania antibodies IgY, two hens were immunized first with the excretory-secretory antigens and the second with somatic antigens. When faced with L. peruviana antigens with IgY it was noted that somatic antigens produced ten antigenic bands with molecular weights of 10, 12, 17, 20, 31, 38, 69, 87, 93 and 105 kDa; with excretory-secretory antigens nine antigenic bands of molecular weights of 17, 20, 31, 52, 67, 78, 87, 93 and 105 kDa were produced, observing five common antigens 20, 31, 87, 93 and 105. Such somatic and excretory-secretory antigens by promastigotes of L. peruviana that have been detected by electroblotting technique could be used in the future for diagnosis of cutaneous leishmaniasis.La finalidad del presente estudio fue determinar los antígenos somáticos y de excreciónsecreción de Leishmania peruviana por electroinmunotransferencia utilizando anticuerpos IgY producidos en Gallus gallus inmunizados experimentalmente. Los antígenos fueron obtenidos por centrifugación de promastigotas cultivados a 37°C por 20 h en Minimun Essential Medium- Eagle (MEM-Sigma), el sobrenadante contenía a los antígenos de excresión-secresión y el sedimento a los antígenos somáticos. Para obtener los anticuerpos IgY anti-leishmania, se inmunizaron dos gallinas, a la primera con antígenos de excresión-secresión y a la segunda con antígenos somáticos. Al enfrentar los antígenos de L. peruviana con la IgY se observó que los antígenos somáticos produjeron diez bandas antigénicas con pesos moleculares de 10, 12, 17, 20, 31, 38, 69, 87, 93 y 105 kDa; y los antígenos de excreción-secreción nueve bandas antigénicas de pesos moleculares de 17, 20, 31, 52, 67, 78, 87, 93 y 105 kDa, observándose cinco antígenos comunes de 20, 31, 87, 93 y 105. Dichos antígenos somáticos y excreción-secreción de promastigotas de L. peruviana que han sido detectados por la técnica de inmunoelectrotranferencia podrían ser utilizados en un futuro para el diagnóstico de leishmaniosis cutánea

Comparación de antígenos de excreción-secreción de epimastigotes (ESEA) y tripomastigotes (TESA) de Trypanosoma cruzi mediante Western blot para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas

La enfermedad de Chagas es causada por el protozoario Trypanosoma cruzi y se presenta como una enfermedad de naturaleza crónica cuyo diagnóstico serológico depende la calidad del antígeno. En la presente investigación se comparó el número, peso molecular y reactividad antigénica mediante Electroinmunotransferencia “Western Blot”, usando pooles de sueros positivos a la enfermedad de Chagas, de antígenos de excreción-secreción de epimastigotas (ESEA) y tripomastigotes (TESA) de T. cruzi cepa “C4” proveniente del departamento de Arequipa (Perú). Para ello, los epimastigotas fueron incubados en medio Bifásico (agar BHI-sangre/PYLB) por 15 días, a temperatura ambiente, y luego de en Minimum Essential Medium (MEM) para obtener los antígenos ESEA; los TESA, por su parte, se obtuvieron del mismo modo que para los ESEA, incluyendo una fase de transformación denominada Metaciclogénesis. La concentración de las proteínas se determinó mediante el método colorimétrico de Bradford. Mediante “Western Blot”, finalmente, se determinó los perfiles antigénicos de los ESEA y de los TESA de la cepa “C4” registrando 22 bandas y 23 bandas, respectivamente, comprendidas en un rango de 100 a 10 kDa para cada una de ellas. Se concluye que existe mayor reactividad antigénica para los TESA, además de la presencia de una banda de 18 kDa de los TESA en relación a los ESEA, al comparar los antígenos de excreción-secreción de epimastigotas (ESEA)  y tripomastigotes (TESA) de Trypanosoma cruzi  cepa “C4”, evaluadas mediante Electroinmunotransferencia.Palabras clave: antígenos ESEA, antígenos TESA, Trypanosoma cruzi, Western blot

EVALUACIÓN MEDIANTE UN INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO (ELISA) DE ANTÍGENOS DEL FLUIDO SEUDOCELOMATICO DE Toxocara canis PARA DETECTAR ANTICUERPOS ESPECÍFICOS

Toxocara canis es un parásito cuyas larvas L3 causan la toxocariasis humana, zoonosis de distribución mundial con elevadas prevalencias en áreas neotropicales. La toxocariasis se diagnostica mediante la prueba inmunoenzimatica (ELISA) indirecta con antígenos de excreción-secreción (TES), considerada la prueba de referencia; sin embargo, existen otros tipos de antígenos aun no investigados. En la presente investigación se evaluó el rendimiento (la capacidad) de una prueba de ELISA indirecta utilizando como antígeno al sobrenadante del fluido seudocelómico de las formas adultas hembras de Toxocara canis (TFS). Los parásitos fueron recolectados de cachorros de perro (Canis lupus familiaris) naturalmente infectados y el TFS se obtuvo en condiciones de esterilidad cortando el extremo final del parásito y luego centrifugado. La concentración de proteínas se midió con un kit de Bradford (KB) y la antigenicidad mediante la técnica de Western blot (Wb) con suero hiperinmune de conejo experimentalmente inmunizado. Las pruebas de ELISA se hicieron con el TFS y 20 sueros positivos a Toxocara, 10 sueros positivos a otras parasitosis y negativos a Toxocara y 52 sueros de niños de una zona rural de la provincia de Pataz (La Libertad, Perú). El punto de corte fue de 3,0 a densidades ópticas de 450 nm en un lector de ELISA (Perkin-Elmer). Se encontró, mediante el KB una concentración de proteínas de 3500 ug/uL y mediante el Wb, 18 bandas reactivas (entre 9,1 y 87,2 KDa). Todos los sueros positivos de la seroteca resultaron también positivos y los positivos a otras parasitosis resultaron negativos. En el lote de sueros de niños de la zona rural se encontró un porcentaje de 7,8% (4/52). En conclusión, La prueba de ELISA indirecta utilizando como antígeno el sobrenadante del fluido seudocelómico de las formas adultas hembras de Toxocara canis obtenidas de perro, Canis lupus familiaris, infectado naturalmente rinde adecuadamente (es eficaz) en la detección de anticuerpos específicos. Palabras clave: Antigenicidad, Canis lupus familiaris, ELISA, fluido seudocelomico, Toxocara canis Abstract Toxocara canis is a causative agent of human toxocariasis, a zoonosis with a worldwide distribution with high prevalences in Neotropical areas. Toxocariasis is diagnosed by indirect enzyme immunoassay (ELISA) with excretion-secretion antigens (TES), considered the gold standard test; however, there are other types of antigens not yet investigated. In the present investigation, the performance (capacity) of an indirect ELISA test was evaluated using the supernatant of the pseudocoelomic fluid of the adult female forms of Toxocara canis (TFS) as antigen. The parasites were collected from naturally infected dog puppies (Canis lupus familiaris) and the TFS was obtained under sterile conditions by cutting the end of the parasite and then centrifuging. Protein concentration was measured with a Bradford kit (KB) and antigenicity by Western blot technique (Wb) with experimentally immunized rabbit hyperimmune serum. The ELISA tests were made with the TFS and 20 sera positive for Toxocara, 10 sera positive for other parasites and negative for Toxocara, and 52 sera from children from a rural area of the Pataz province (La Libertad, Peru). The cut-off point was 3.0 at optical densities of 450 nm in an ELISA reader (Perkin-Elmer). A protein concentration of 3500 ug/uL was found by KB and 18 reactive bands (between 9.1 and 87.2 KDa) were found by Wb. All the positive sera from the seroteca were also positive and those positive for other parasites were negative. A percentage of 7.8% (4/52) was found in the lot of sera from children in rural areas. In conclusion, the indirect ELISA test using as antigen the supernatant of the pseudocoelomic fluid of the adult female forms of Toxocara canis obtained from the naturally infected dog, Canis lupus familiaris, performs adequately (is effective) in the detection of specific antibodies. Keywords: Antigenicity, Canis lupus familiaris, ELISA, pseudocoelomic fluid, Toxocara canis *Autor para correspondencia: E mail: [email protected] DOI: http://dx.doi.org/10.17268/rebiol.2021.41.01.0

Antígenos de excreción-secreción de tripomastigotas de Trypanosoma cruzi detectados por Western Blot usando sueros de pacientes con parasitosis confirmada

La enfermedad de Chagas, enfermedad parasitaria causada por el protozoario Trypanosoma cruzi, se caracteriza por su endemicidad y silencioso proceso sin manifestaciones clínicas por tiempo prolongado, a veces décadas, de cuya cronicidad resultan episodios fatales. El parásito posee varias formas evolutivas y dos huéspedes: un vertebrado (hombre y otros mamíferos) y otro invertebrado, el vector (triatominos). Debido a que no se cuenta con un diagnóstico serológico estandarizado que permita el análisis confiable de poblaciones en riesgo de modo tal que pueda proponerse la implementación de tratamientos oportunos, se planteó una investigación dirigida a identificar a los antígenos de excreción-secreción de los tripomastigotas de Trypanosoma cruzi obtenidos por metaciclogénesis de epimastigotas cultivados a partir de tripomastigotas metacíclicos aislados de  Panstrongylus chinai   naturalmente infectado en el valle Chamán (La Libertad) mediante la técnica de Western blot utilizando sueros de pacientes con enfermedad de Chagas confirmada. Para ello, los cultivos de epimastigotas se hicieron en medio BHI/PYLB, la metaciclogénesis en Grace´s Insect Medium (Sigma) suplementado con suero bovino fetal y la obtención de productos excretados-secretados en Eagle´s Minimun Essential Medium (Sigma). Se obtuvo 60% de metaciclogénesis a tripomastigotas con patogenicidad comprobada en ratones BALB/c, asimismo, 24 bandas reactivas mediante el Western blot, con pesos moleculares variables entre 13.8 y 97.4 KDa y dos grupos de bandas de mayor reactividad: de 21 a 31 y de 45 a 100 KDa. De ellas, la banda de 43.7 KDa también apareció cuando se cruzaron con sueros de pacientes con toxoplasmosis y leishmaniasis.Palabras clave: Enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi, Panstrongylus chinai, Western blo

Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de Piper aduncum sobre la supervivencia de tripomastigotes de Trypanosoma cruzi

Se determinó el efecto “in vitro” del extracto hidroalcohólico de las hojas de matico, Piper aduncum, sobre los tripomastigotas de Trypanosoma cruzi C1 obtenidos por metaciclogénesis a partir de epimastigotas. Los epimastigotes fueron cultivados en medio bifásico BHI/PYLB y la metaciclogénesis fue inducida en Grace’s Insect Medium. La susceptibilidad de los tripomastigotes frente al extracto hidroalcohólico de las hojas de matico se evaluó enfrentando el extracto disuelto en DMSO, a las concentraciones de 0.5 mg/mL, 0.96 mg/mL y 1.90 mg/mL con los tripomastigotas cultivados en medio GRACE’S. La supervivencia se midió mediante el recuento en hemocitómetro de flagelados móviles comparados con el control (sin matico). Se observó inmovilidad en las tres concentraciones empleadas en proporción directa con la concentración: a mayor concentración mayor inmovilidad. Palabras clave: Trypanosoma cruzi; Pipper aduncum; extracto hidroalcohólico; efecto tripanocida

Signos y alteraciones histopatológicas en Mus Musculus BALB/c infectados con Trypanosoma cruzi procedente de Arequipa y de Amazonas (Perú)

Se determinó a los signos y alteraciones histopatológicas producidos por dos cultivos de Trypanosoma cruzi, uno procedente del Departamento de Arequipa (C-Areq) ubicado en el sur del Perú y otro del Departamento de Amazonas (C-Utc) ubicado en el norte peruano en Mus musculus BALB/c. Los epimastigotes mantenidos en medio bifásico BHI/PYLB se subcultivaron en medio Grace’s Insect para obtener los tripomastigotas metacíclicos. Se utilizaron 22 ejemplares de M. musculus BALB/c: 10 se inocularon con C-Areq, 10 con C-Utc y 2 fueron inoculados con SSF (testigo). Se evaluó los niveles de parasitemia, y los signos y alteraciones histopatológicas en el modelo animal. A los 20 días post inoculación (pi), se encontró niveles de parasitemia de6,6x107 tripomastigotas sanguíneos de la población C-Areq, cifra superior a la alcanzada por la población C-Uct (1,7x106) en  el  mismo periodo. El  estudio histopatológico del  encéfalo de  ratones inoculados con ambas poblaciones del protozoario mostró, edema, congestión vascular, células gliales, necrosis y grupos (nidos) de amastigotas de T. cruzi; del miocardio, también grupos de amastigotes, edema, congestión vascular, hemorragia y necrosis y del hígado se observó una marcada congestión vascular y balonamiento. La totalidad de los ratones del  grupo  experimental inoculados con  tripomastigotes de  T. cruzi procedentes de  Arequipa,  presentaron diferente comportamiento en relación al ratón control. Se observó erizamiento del pelo, agitación y parálisis de extremidades inferiores, muriendo la totalidad de ejemplares, sin embargo, en los ratones inoculados con la población de T, cruzi C-Uct no apareció el erizamiento del pelo, pero sí se observó agitación de los ejemplares, muriendo la totalidad de ellos.Palabras clave: Parasitemia, signos, alteraciones histopatológicas, Mus musculus BALB/c, Trypanosoma cruz

Prevalence of fascoliasis in sheep and cattle in the province of Pataz, La Libertad, Peru through coproparasitological tests and Western Blot

El estudio tuvo como objetivo determinar la prevalencia de fascioliasis en ovinos y bovinos en cinco distritos de la Provincia de Pataz, La Libertad, Perú, mediante examen coprológico y western blot. El estudio fue de tipo transversal prospectivo. Se evaluaron muestras de heces y de sangre de 388 ovinos y 365 bovinos de los distritos de Buldibuyo, Chillia, Huaylillas, Taurija y Urpay, entre abril y octubre de 2015 por los métodos de formol-éter y Kato Katz y de Western Blot. El 61.8% de ovinos y el 86.8% de bovinos presentaron anticuerpos anti-Fasciola hepatica (serología positiva) y el 42.3% de los ovinos y el 62.4% de los bovinos presentaron huevos de F. hepatica en heces (coprología positiva). Los distritos de Buldibuyo, Chillia y Huaylillas presentaron las mayores prevalencias de fascioliasis, tanto en ovinos como en bovinos. Se concluye que la provincia de Pataz puede ser considerada zona hiperendémica a fasciolosis por Fasciola hepatica.The aim of this study was to determine the prevalence of fascioliasis in sheep and cattle in five districts of the Province of Pataz, La Libertad, Peru, through coprological tests and Western blot. The study was a prospective cross-sectional type. Faecal and blood samples from 388 sheep and 365 cattle were evaluated from the districts of Buldibuyo, Chillia, Huaylillas, Taurija and Urpay, between April and October 2015 by the methods of formalin-ether and Kato Katz and Western Blot. Results showed than 61.8% of sheep and 86.8% of cattle presented anti-Fasciola hepatica antibodies (positive serology) and 42.3% of sheep and 62.4% of bovines presented eggs of F. hepatica in faeces (positive coprology). The districts of Buldibuyo, Chillia and Huaylillas presented the highest prevalence of fascioliasis in both ovine and bovine. It is concluded that the province of Pataz can be considered hyperendemic zone to fasciolosis by Fasciola hepatica