Endocardial-mesenchymal transition underlies fusion of the conotruncal ridges during embryonic cardiac outflow tract septation

The embryonic cardiac outflow tract (conotruncus) is a single tubular chamber that connects the right ventricle with the aortic arch arteries. It contains two opposite, long and helical mesenchymal cushions covered by endocardial cells (conotruncal ridges). Conotruncal division (septation) gives rise to the adult right and left outflows together with the aortic and pulmonary valves. It takes place by fusion of the two opposite ridges and formation of the conotruncal septum. Although the participation of neural crest cells in septation is well established, the mechanism of fusion of the conotruncal ridges remains unknown. Defects in fusion have been shown to produce bicuspid aortic valve, the most prevalent human congenital cardiac malformation, in a hamster model. Three fusion mechanisms have been proposed to operate during embryonic development: epithelial adhesion, epithelial apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT). The first mechanism entails the expression of adhesion molecules and the maintenance of the identity of cells in contact, whereas in the other two, epithelial cells covering the fusing structures disappear by apoptosis or by transforming into mesenchymal cells. The objective of this study is to elucidate the mechanism involved in the fusion of the conotruncal ridges. Immunofluorecence techniques were used in ED 11-12 hamster embryos. The results indicate that the mechanism of EMT, but not epithelial adhesion or apoptosis, is involved in the process of fusion of the conotruncal ridges. The EMT mechanism associated with conotruncal septation seems to be uncoupled from the process of formation of the endocardial cushions, which takes place at early stages. With these results, we can raise the hypothesis that defects in the EMT process may lead to different morphological types of bicuspid aortic valve.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. This study was supported by P10-CTS-6068 (Junta de Andalucía), CGL2014-52356-P and CGL2017-85090-P (Ministerio de Economía y Competitividad), contract UMAJI75 (Junta de Andalucía, European Social Fund), and Universidad de Málaga

Myocardial trabeculation in embryos of Scyliorhinus canicula (Elasmobranchii, Chondrichthyans)

Currently, three types of ventricular myoarchitecture are recognized in vertebrates, namely compact, spongy (trabeculated) and mixed myocardium. Mixed myocardium, which has been recently proposed as the primitive condition in gnathostomes, is composed of two myocardial layers: an inner trabeculated and an outer compact one. The trabeculation process has been studied in teleosts, showing exclusively spongy myocardium, and mammals and birds, characterized by a compact myocardial ventricular wall. In zebrafish, mouse and chicken embryos, the trabeculae develop as luminal myocardial ridges protruding into the lumen. In mammals and birds, further compactation of trabeculae leads to the formation of a compact layer. The potential mechanisms that may contribute to the formation of the ridges are under discussion and include myocardial proliferation, endocardial invagination, and bending of the entire myocardial layer. However, no description of the development of the mixed myocardium is available. To shed some light on this issue, we have studied the heart development of an elasmobranch species with mixed myocardium, the lesser spotted dogfish (Scyliorhinus canicula; Chondrichthyes), by means of histological and immunohistochemical techniques for light microscopy, semithin sections, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Our results suggest that in the dogfish the intertrabecular spaces develop by connections between early intramyocardial spaces and the lumen of the ventricle through invaginations of the endocardial line. Chondrichthyans are the earliest diverged lineage of gnathostomes and, consequently, they have the most primitive cardiac design. Although chicken, mouse, and recently zebrafish have been considered powerful vertebrate models to study heart development, we propose that the trabeculation process in the dogfish is representative of the early steps of the ventricular morphogenesis in vertebrates.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.Study supported by grant CGL2017-85090-P and CGL2014-52356-P (Ministerio de Economía y Competitividad), FPU15/03209 (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte), FEDER, and Universidad de Málaga

Chamber specific expression of Myosin heavy chain 7b in the heart of vertebrates

In extant vertebrates, myosin heavy chain (MyHC) 6 and 7 are the main isoforms of atrial and ventricular myocardium respectively, whereas MyHC7b has been proposed to be an ancient cardiac isoform only expressed during embryonic development in modern species. In preliminary immunohistochemical studies of the heart of the lesser spotted dogfish (Scyliorhinus canicula; Chondrichthyes), we have observed that while MF20 labels homogeneously all the myocardium, A4.1025 labels the inflow cardiac segments (sinus venosus and atrium) but not the outflow segments (ventricle and conus arteriosus). In order to interpret these results, we have performed western and slot blots from samples of dogfish and hamster (Mesocricetus auratus) hearts, HPLC-ESI-MS/MS from dogfish samples, and immunohistochemistry in hearts of representative species of vertebrates, namely elasmobranchs, polypteriforms, acipenseriforms, teleosts and mammals, using MF20 and A4.1025 antibodies. Western and slot blot results confirmed the specificity of MF20 and A4.1025 for MyHC in dogfish, as well as their differential reactivity against different myocardial segments. HPLC-ESI-MS/MS using protein databases from Callorhinchus milii (Chondrichthyes) and Chordata revealed the presence of MyHC6 and 7 in all the dogfish myocardial segments, and of MyHC7b only in the outflow segments. Immunohistochemistry showed that while MF20 signals were homogeneous in all the myocardial segments of all the species studied, A4.1025 signals were restricted to the inflow myocardial segments in elasmobranchs, homogeneous in teleosts and acipenseriforms, and low in the ventricle of polypteriforms. It can be inferred that the A4.1025 antibody, as opposed to MF20, has a low affinity for MyHC7b, at least in the dogfish. In addition, we show that MyHC distribution in the cardiac chambers has changed during the evolution of gnathostomes.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.Study supported by grants CGL2017-85090-P and CGL2014-52356-P (Ministerio de Economía y Competitividad), FPU15/03209 (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte), contract UMAJI75 (Junta de Andalucía, European Social Found), FEDER and Universidad de Málaga

The anatomical components of the cardiac outflow tract of the bichir, polypterus senegalus. Evolutionary significance

El resumen aparece en el Program & Abstracts of the 10th International Congress of Vertebrate Morphology, Barcelona 2013.Anatomical Record, Volume 296, Special Feature — 1: P-077.In chondrichthyans and actinopterygians, the outflow tract of the heart, namely, the cardiac portion intercalated between the ventricle and the ventral aorta, consists of two anatomical components: conus arteriosus and bulbus arteriosus. In chondrichthyans and extant representatives of phylogenetically ancient actinopterygian groups, the conus and bulbus are well-developed in size, whereas in most teleosts, the bulbus is markedly larger than the conus. Current knowledge about the cardiac outflow tract of the polypteriformes is scarce and highly contradictory, a fact that contrasts with their crucial phylogenetic position at the source of the actinopterygian lineage. In fact, it remains uncertain whether they have a bulbus at the arterial pole of the heart. The present study aimed to elucidate the anatomical arrangement of the cardiac outflow tract of the bichir in an attempt to improve our understanding of the evolution of the vertebrate heart. We examined the hearts from 12 bichirs using histochemical and immunohistochemical techniques. Our findings showed that the outflow tract of the bichir consists of two components, namely, a long conus arteriosus, largely composed of myocardial tissue and furnished with a variable number of valves at its luminal side, and a very short, elastin rich bulbus arteriosus, devoid of myocardium. The bulbus has an arterial-like histological composition. However, it differs from the aorta because it has a thicker wall, shows a different arrangement of the histological elements, is covered by the epicardium and is crossed by coronary arteries. The present observations are consistent with the notion that the conus arteriosus and the bulbus arteriosus have coexisted from the beginning of the jawed vertebrate radiation. This is of particular interest, because there is evidence that the bulbus arteriosus, which is a second heart field derivative, is homologous with the intrapericardial portions of the aorta and pulmonary artery of birds and mammals.Proyecto CGL2010-16417/BOS; Fondos FEDER

Herencia del origen anormalmente alto de una arteria coronaria (high take-off) en un modelo animal

Este artículo se ha publicado en: Rev Esp Cardiol 2016, 69, supl. 1:1148.Introducción y objetivos: En el hombre, el origen anormalmente alto de una arteria coronaria o high take-off (HTO) es una anomalía congénita consistente en la localización de un ostium coronario en la aorta ascendente, por encima del límite seno-tubular. El HTO tiene una incidencia del 0,36% en la población general y suele estar acompañado de un ostium en forma de hendidura y de un recorrido intramural de la porción proximal del tronco coronario, lo que puede causar isquemia miocárdica e insuficiencia cardiaca. El HTO se asocia a muerte súbita cardiaca en aproximadamente el 1,53% de los casos. Nuestro grupo ha demostrado que el HTO coronario es un carácter habitual en algunas cepas de ratones de laboratorio, usualmente asociado a ostium en hendidura y recorrido proximal intramural. La cepa C57BL/6 (B6) muestra una incidencia del 58% de HTO, mientras que en la cepa Balb/c (Bc) la incidencia es nula. Métodos: A fin de comprobar si el HTO es un carácter heredable, se ha examinado la posición y la forma de los ostium coronarios, mediante estereomicroscopia y microscopia electrónica de barrido, en ratones B6 (n = 36), Bc (n = 40) e híbridos Bc × B6 (F1; n = 84), F1 × F1 (F2; n = 27), F1 × B6 (F2B6, n = 44) y F1 × Bc (F2Bc, n = 80). Resultados: La incidencia de HTO en los animales híbridos presentó valores intermedios respecto a los de los parentales (F1: 28%; F2: 26%; F2B6: 46%; F2Bc: 13%). En la mayoría de los casos con HTO, los ostium coronarios tenían forma de hendidura o aberrante y la porción proximal del tronco coronario presentaba un curso intramural. Conclusiones: Estos resultados demuestran que el HTO es un carácter heredable en el ratón. Su transmisión hereditaria se ajusta a un modelo con un alelo principal dominante y un alelo modificador dominante que reduce a la mitad la incidencia del carácter. A tenor de estos datos, es posible plantear estrategias de búsqueda de mutaciones causales de HTO, utilizando mapas de ligamiento con ratones híbridos de las cepas B6 y Bc, portadores y no portadores de HTO, seguido de secuenciación genética en pacientes afectos. Conocer una mutación causal de HTO permitiría (1) desarrollar test genéticos para identificar pacientes afectos y (2) obtener datos relevantes sobre los mecanismos morfogenéticos implicados en el desarrollo embrionario de las arterias coronarias.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. PI-0888-2012 (Junta de Andalucía). Red de Investigación Cardiovascular (RIC; RETICs). FPU15/03209 (MECD

El origen anatómico de la arteria coronaria septal del hámster sirio es un carácter heredable

Este artículo se ha publicado en: Rev Esp Cardiol 2016, 69, supl. 1:683.Introducción y objetivos: En los roedores, incluidos los empleados en el laboratorio, las arterias coronarias son intramiocárdicas. Normalmente se distinguen 3 arterias coronarias, la derecha, que irriga el corazón derecho, la izquierda, que irriga el corazón izquierdo, y la septal, que irriga el septo interventricular. En el hámster sirio, una especie empleada como modelo en estudios sobre anomalías congénitas de las arterias coronarias, la arteria septal se origina de la coronaria derecha o de la izquierda, o de un ostium propio en el seno aórtico correspondiente. El objetivo fue averiguar si el origen anatómico de la arteria septal del hámster está sujeto a factores hereditarios. Métodos: Se estudiaron moldes internos del corazón de un total de 483 hámsteres, seleccionados de 74 camadas y sus progenitores. Todos los animales tenían arterias coronarias normales. Con los datos obtenidos, se calculó la incidencia del origen de la arteria septal (izquierda o derecha) en individuos cuyos parentales presentaban (1) ambos septal izquierda, (2) ambos septal derecha y (3) uno septal derecha y el otro izquierda. Mediante el test de χ2, se verificó la hipótesis de que el origen de la arteria septal de un individuo es independiente del que presentan sus parentales. Resultados: La proporción de arterias septales derecha e izquierda varió significativamente dependiendo del fenotipo parental (χ2 = 33,121, p < 0,001). La arteria septal izquierda fue más frecuente de lo esperado en animales cuyos parentales tenían ambos arteria septal izquierda (p < 0,01), mientras que la arteria septal derecha lo era en animales en los que uno (p < 0,001) o ambos (p < 0,001) parentales tenían arteria septal derecha. Conclusiones: Los presentes resultados son los primeros en demostrar la influencia de factores genéticos en las variaciones anatómicas de un patrón arterial coronario, en particular de la arteria septal del hámster. Estos hallazgos son consistentes con el hecho de que, en humanos, determinadas características morfológicas del árbol arterial coronario asociadas a la enfermedad coronaria tienen un componente genético patente. El estudio del sustrato genético que subyace al establecimiento de los patrones anatómicos de las arterias coronarias en roedores puede contribuir a identificar marcadores de susceptibilidad a la enfermedad coronaria humana.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. PI-0888-2012 (Junta de Andalucía). Red de Investigación Cardiovascular (RIC; RETICs

Embryology of the abnormally high origin of a coronary artery (High Take-Off) in a mouse model.

High take-off (HTO) is a rare congenital coronary artery anomaly associated with sudden cardiac death. The coronary ostium is located in the ascending aorta above the sinotubular junction. The morphogenetic defect leading to HTO is currently unknown. Our group has shown occurrence of HTO in different strains of laboratory mice, including C57Bl/6 strain with 58% incidence of HTO and Balb/c strain with null incidence. Our aim is to investigate the aetiology of HTO, using C57BL/6 and Balb/c mice strains as experimental models. The process of coronariogenesis was examined in E13.5 and E14.5 mouse embryos of C57Bl/6 (n=27) and Balb/c (n=23) strains. We used histochemistry and immunohistochemistry with specific markers for the vascular plexuses involved in the formation of coronary arteries (PROX1 and ERG 1/2/3). In the mouse embryo, coronary ostia develop at approximately stage E14.5. The location of the ostia is determined by the confluence of two vascular plexuses. The transient lymphatic subepicardial aortic plexus migrates from the pharyngeal region, invading the subepicardial space of the intrapericardial thoracic arteries at around E13.5. The primary or ventricular plexus, which constitutes the future coronary vascular network, forms in situ, reaching the embryonic cardiac outflow tract at around E14. Eighteen of the 27 (66.7%) C57Bl/6 embryos showed an exacerbated subepicardial aortic plexus compared to the 23 Balb/c embryos, in which the subepicardial aortic plexus exhibited a normal size. These results suggest that the embryonic origin of HTO could be due to a defect in the growth of the subepicardial aortic plexus, resulting in an exacerbated vessel network. This overgrowth seems to alter the invasion and connection of the primary plexus to the aortic root for the establishment of the ostia and coronary trunks. From a biomedical viewpoint, it would be of great interest to investigate the molecular mechanisms underlying the overgrowth of the aortic plexus.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech; PI-0530-2019 (Consejería de Salud y Familias, Junta de Andalucía); UMA20-FEDERJA-041 (Junta de Andalucía y Fondos FEDER); PROYEXCEL_01009 (PAIDI, Junta de Andalucía); PRE2018-083176 (Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades), CONT-FIMABIS-0610/2023 (Junta de Andalucía)

El tracto de salida del corazón de Chimaera monstrosa.

La quimera (Chimaera monstrosa) es un holocéfalo que habita aguas profundas del mar de Alborán. Aunque hay descripciones puntuales desde finales del siglo XIX sobre el corazón de esta especie, no ha sido hasta fechas recientes cuando se ha puesto de manifiesto que el tracto de salida cardiaco de los Holocéfalos, al igual que el de los Elasmobranquios, consta de dos componentes: el cono arterioso, proximal, de naturaleza miocárdica, y el bulbo arterioso, distal, no miocárdico. Por primera vez, se ha efectuado un estudio anatómico e histomorfológico del tracto de salida en esta especie. Para ello, se han examinado diez corazones de ejemplares capturados en el mar de Alborán, tanto macroscópicamente como mediante microscopía electrónica de barrido y técnicas histológicas para microscopía óptica. En los especímenes estudiados, la pared del bulbo arterioso contiene musculatura lisa y elastina. En cambio, el cono arterioso, que ocupa en torno al 75% de la longitud total del tracto de salida, posee miocardio en su pared, está recorrido por arterias coronarias y presenta superficialmente melanóforos. El cono está provisto internamente de válvulas conales, organizadas en dos hileras, cuyo número varía según los individuos. Suele haber cuatro válvulas proximales y de cuatro a seis distales que contribuyen a evitar el reflujo de sangre hacia el ventrículo durante el ciclo cardiaco. Cada válvula consta de una valva, que se abre y se cierra durante el ciclo cardiaco, anclada a su correspondiente seno, que es la parte de la pared del tracto de salida que la soporta. Las válvulas están estratificadas en una fibrosa externa, una esponjosa y una fibrosa interna. Aunque los componentes histológicos de las válvulas proximales y distales son semejantes, existen algunas diferencias en cuanto a su organización histomorfológica. Los presentes resultados contribuyen a completar la visión general sobre la estructura del tracto de salida cardiaco en los Condrictios.Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech; BIO-203 (PAIDI, Junta de Andalucía); CONT-FIMABIS-0610/2023 (Junta de Andalucía); PRE2018-083176 (Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades) y FEDE

Etiología del origen anormalmente alto de una arteria coronaria (High Take-Off) en el modelo ratón

El origen anormalmente elevado de una arteria coronaria (“high take-off”, HTO) es una anomalía congénita rara asociada a muerte súbita cardiaca. Consiste en la localización de un ostium coronario en la aorta ascendente, sobre la unión senotubular. Actualmente se desconocen los defectos morfogenéticos que, durante el desarrollo embrionario, conducen a la formación de un HTO. Nuestro grupo ha demostrado que la incidencia de HTO varía en distintas cepas de ratón de laboratorio, siendo del 58% en la cepa C57Bl/6, y 0% en la cepa Balb/c. El objetivo de este estudio es indagar en la etiología del HTO en el modelo ratón, utilizando estas dos cepas como modelos experimentales. Se ha analizado el proceso de coronariogénesis en embriones de ratón de 13,5-14,5 días post-coitum de las cepas C57Bl/6 y Balb/c mediante histoquímica e inmunohistoquímica, utilizando marcadores específicos para los plexos vasculares implicados en la formación de las arterias coronarias. Los ostia coronarios aparecen en el embrión de ratón aproximadamente en el día 14,5. La localización de los ostia viene determinada por la confluencia de dos plexos vasculares, el plexo aórtico subepicárdico de naturaleza linfática y transitoria, que migra desde la región faríngea, y el plexo primario o ventricular, que constituirá la futura red vascular coronaria y se forma in situ en el corazón embrionario. El 66,7% embriones de la cepa C57Bl/6 analizados mostraban un plexo aórtico subepicárdico de gran tamaño en comparación con los de la cepa Balb/c, en los que dicho plexo presentaba un tamaño normal. La exacerbación del plexo aórtico presentaba distintos grados de severidad. El origen embrionario del HTO parece deberse a un defecto en la formación y el crecimiento del plexo aórtico subepicárdico, dando lugar a una red de vasos exacerbada. Esta exacerbación podría alterar la invasión y conexión del plexo primario para el establecimiento de los ostia y troncos coronarios.CGL2017-85090-P, PI-0530-2019, PRE2018-083176 y FEDER. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech