Identificación rápida de bacterias aisladas de pacientes fibroquísticos mediante espectroscopía infrarroja y análisis multivariante

A partir del año 2004 se ha registrado en el Hospital de Niños de La Plata, un aumento en el número de aislamientos de B. cepacia en pacientes fibroquísticos (FQ), así como también en niños con otras patologías. La identificación rápida y precisa de estas bacterias resulta esencial para la iniciación del tratamiento adecuado. Los métodos bioquímicos empleados de rutina para la identificación microbiológica, no brindan por lo general resultados certeros, demandan al menos 5 días de análisis y sólo permiten discriminar hasta el nivel de especie. Sin embargo, las bacterias identificadas como "B. cepacia" comprenden un grupo de 9 especies o genomovares altamente relacionados, denominado colectivamente el Complejo B. cepacia. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una estrategia que permitiera la identificación y caracterización rápida de organismos aislados de muestras de esputo de pacientes FQ a nivel de subtipo de genomovar, basada en el empleo de espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) combinada con técnicas de análisis multivariante. Se obtuvieron espectros de 14 aislamientos hospitalarios y 16 cepas de referencia previamente confirmadas por técnicas de biología molecular (PCR y corte con enzimas de restricción) en un espectrómetro Perkin Elmer (Spectrum One). Para ello se utilizaron colonias obtenidas en medio sólido en condiciones estandarizadas, proveniente de un cultivo confluente resuspendidas en H2O, transferidas a una celda de ZnSe y llevadas a sequedad hasta obtener un film homogéneo y transparente. Los espectros se normalizaron y sus derivadas primeras fueron sometidas a diferentes análisis multivariantes para su diferenciación y construcción de librerías espectrales. Se desarrollaron y compararon dos sistemas de caracterización, diferenciación e identificación basados en: 1) análisis de clusters (AC) empleando el coeficiente de Pearson y el algoritmo de Ward (software OPUS V.4.0, Bruker Optics, USA) y 2) un sistema de redes neuronales artificiales (ANNs) que discrimina en tres diferentes niveles (género, genomovar y subtipo), entrenado aplicando diferentes algoritmos (NeuroDeveloper© software, Germany). Se demostró que FT-IR combinada con AC y/o ANNs permite la identificación rápida (menos de 36 horas), precisa y a bajo costo de organismos de interés clínico.Ganador al premio Mejor Trabajo Científico de las Cuartas Jornadas de Actualización en Clínica Pediátrica 200

Study of a bacterial consortium adapted to low bioavailability to phenanthrene, as potential inoculant to chronically PAH contaminated soils

Due to the reduced bioavailability that characterizes chronically hydrocarbons contaminated soils, the bioaugmentation with cultures obtained by enrichment in solid phase systems, could be a promissing strategy to apply in aged contaminated soils. In this context, the objective of this work was to study four bacterial component obtained from a degrader phenanthrene consortium by using solid phases with a resin XAD2 preloaded with phenanthrene, and to rebuild a defined degrading consortium from them. The isolated strains were identified by 16S rRNA and phenotypically characterized using the conventional assays. Furthermore, their main phenotypic features and biochemical characteristics where analyzed by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR). The phenanthrene degradation was studied from both in the strain pure cultures and from the defined consortium. Our results showed that the application of XAD2 preloaded with phenanthrene culture systems represents a selective environment towards substrate colonizing bacterial species and allow us study the different strategies to enhance the PAH uptake and allow the bacterial survival in oligotrophic conditions

Study of bacterial defined consortium adapted to low phenanthrene bioavailability

A general problem of bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) contaminated soil is that the degradation appears rather slow, due to the propensity of these nonpolar contaminants to adsorb strongly to organic matter. The establishment of microniches of PAH degrading bacteria in an aged PAH contaminated soil represents a process strongly influenced by the manner in which the PAH are exposure in the soil and bacterial capability to develop physiological strategies to adapt to the PAH bioavailability. Due to the reduced bioavailability, the bioaugmentation strategy with cultures obtained by enrichment in solid phase systems, could be a promising strategy to apply in aged contaminated soils. Applying an enrichment method with the phenanthrene provided in a sorbed state, a degrading consortia was previously obtained. The predominant strains from the consortia were isolated and identified as belonging to Sphingobium, Acidovorax, Rhodococcus and Arthrobacter genera (strains C1, C2, C3 and C4, respectively) suggesting that the strains could develop different strategies to integrate the degrader consortium. Because the successful of survival and establishment of a consortium in soil is probably higher than those obtained with the inoculation of only one strain, we focussed our study in understanding how a defined consortium built by these four strains could be more efficient in reducing sorbed phenanthene than pure cultures. The Amberlite® XAD-2 preloaded with phenanthrene (10.8mg of phenanthrene g-1 XAD2) was used as solid model in batch system with mineral medium (10% p/v). Each strain and the defined consortium were inoculated in the solid model in batch system with phenanthrene as only carbon source. Systems without phenanthere were inoculated to evaluate the inespecific adsortion to the resin beads. The biomass developed on the beads was monitoring by R2 agar count and FTIR spectroscopy (evaluating the increase in Amide I band at 1650cm-1) after 10 and 30 days of incubation at 28C. Only the Arthrobacter sp. C4 strain growing as pure culture exceeded the 106 ufc/g of XAD2-Phen after 10d. Both by plate count and FTIR we could determine that, C1 and C4 biomass obtained in pure cultures were more abundant on XAD2 beads than XAD2-Phen, suggesting the strains could degrade the resin. When the four strains were inoculated together in XAD2-Phen, each strain rose to 107 CFU/g and remained this value after 30d. Both the high amount of carbohydrates observed for Acidovorax sp. C2 strain (1200-900cm-1 and 3500cm-1) and the significant production of lipids for Rhodococcus sp. C3 strain (3000-2800 cm-1) could be detected in the defined consortium. These results demonstrated that at least these two strains could establish and express their phenotypes during the consortium development. Both FTIR spectroscopy and HPLC techniques allow the detection of phenanthrene by products accumulation along the pure cultures, which were reduced in the consortium

Informe de personal de apoyo: Bosch, María Alejandra (2011-2012)

Proyectos de investigación en los cuales colabora: a) “Caracterización e identificación de aislados clínicos de Burkholderia cepacia de pacientes fibroquísticos mediante técnicas moleculares y espectroscópicas vibracionales.” Proyecto de la Secretaría de Extensión de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata (Participación: Co-dirección). b) Biofilms microbianos “Biofilm microbianos.Estudio sobre estrategias desarrolladas por organismos patógenos respiratorios para su persistencia en el hospedador.” Proyecto X534, correspondiente al Programa de Incentivos, otorgado por la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de La Plata (Participación: Co-dirección) c) Fertilización asistida “Diseño y desarrollo de una metodología no invasiva para la detección del potencial reproductivo de embriones humanos basada en Espectroscopía Infrarroja con transformada de Fourier combinada con Redes Neuronales Artificiales”. Proyecto ANR 800/2011 del Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva, Fondo Tecnológico Argentino (FONTAR), Convocatoria 2011. Proyecto aprobado NA 183/11. Empresa: CENTRO DE FERTILIDAD BUENOS AIRES S.A. (PREGNA). Directores: Drs. Marcos Horton (PREGNA) y Osvaldo Yantorno (CINDEFI) . Directoes Técnicos: Dres. Marcelo Garcea (PREGNA) y Alejandra Bosch (CINDEFI). Período: 2012-2015

Informe de personal de apoyo: Bosch, María Alejandra (2013-2014)

Proyectos de investigación en los cuales colabora: a) Caracterización molecular y fenotípica de aislamientos clínicos recuperados de infecciones pulmonares crónicas de pacientes fibroquísticos - “Caracterización de cambios fenotípicos asociados a la adaptación de organismos del Complejo Burkholderia cepacia durante la infección pulmonar crónica en pacientes fibroquísticos. Implicancias en la eficiencia del tratamiento antimicrobiano”. Proyecto de la Secretaría de Extensión de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata (Participación: Dirección). Período: Marzo 2014- Diciembre 2016 -“Biofilms como sistema de estudio de aislados clínicos del complejo Burkholderia cepacia recuperados de infeccione pulmonares crónicas en pacientes fibroquísticos” Proyecto correspondiente al Programa de Incentivos, otorgado por la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de La Plata (Participación: Co-dirección). Períodod: 2013-2016. c) Aplicación de métodos espectroscópicos vibracionales en Fertilización Asistida “Diseño y desarrollo de una metodología no invasiva para la detección del potencial reproductivo de embriones humanos basada en Espectroscopía Infrarroja con transformada de Fourier combinada con Redes Neuronales Artificiales”. Proyecto ANR 800/2011 del Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva, Fondo Tecnológico Argentino (FONTAR), Convocatoria 2011. Proyecto aprobado NA 183/11. Empresa: Centro de fertilidad Buenos Aires S.A. (PREGNA). Directores: Drs. Marcos Horton (PREGNA) y Osvaldo Yantorno (CINDEFI) . Directoes Técnicos: Dres. Marcelo Garcea (PREGNA) y Alejandra Bosch (CINDEFI). Período: 2012-2015

Informe científico de investigador: Bosch, María Alejandra Nieves (2013-2015)

Las infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis quística son en general de carácter crónico, lo cual implica que los patógenos deben desarrollar estrategias de adaptación frente a las presiones selectivas impuestas por la limitación de nutrientes, tratamientos antimicrobianos y las defensas del hospedador. Si bien Pseudomonas aeruginosa representa el principal patógeno oportunista de estos pacientes, hemos recientemente reportado una alta prevalencia de organismos del Complejo Burkholderia cepacia (CBc) en pacientes locales. Estas bacterias son fácilmente trasmisibles entre pacientes, son multi-resistentes y pueden producir neumonía necrotizante con reducción en la expectativa de vida del hospedador. El objetivo de nuestras investigaciones es profundizar el conocimiento sobre las características fenotípicas y genómicas de aislados clínicos de B. contaminans recuperados en distintos estadíos de la infección pulmonar crónica y estudiar posibles mecanismos que les permitirían persistir en el hospedador. Estos estudios aportarán información para adecuar estrategias de control de infecciones crónicas