Biosensor 2001 - a Retrospect and Foresight

This editorial gives a short retrospect of the BioSensor Symposium 2001 from the point of view of the organizing committee. The symposium was held from 1st to 3rd of April 2001 at the University of Tübingen. The conference is the only German-speaking forum of its kind and provides a unique setting for new research, trends, and perspectives to be shared with peers from both industrial and educational institutions. The new approach of publishing the conference proceedings electronically by the Universitätsbibliothek Tübingen is explained in detail and the possibilities resulting are discussed

Charakterisierung einer Triazin-Bibliothek mittels markierungsfreier HTS-Reflektometrischen Interferenzspektroskopie

Mittels kombinatorischer Chemie werden heute große Substanzbibliotheken organischer und bioorganischer Verbindungen hergestellt. Eine der Standardmethoden ist die Synthese an festen Phasen. Beim Screening solcher Bibliotheken auf Aktivität gegenüber einem bestimmten Target bieten solche Verfahren einen Vorteil, die die Aktivitätsbestimmung, direkt an der festen Phase erlauben und somit das aufwendige Abspalten und Aufreinigen der großen Zahl an Einzelsubstanzen von der Festphase ersparen. Zur Realisierung eines solchen Systems wurde die Festphasensynthese einer Bibliothek in modifizierten Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Böden solcher Mikrotiterplatten bestehen aus einer dünnen SiO2-Schicht, die auf eine Glassubstrat aufgetragen wurde. Eine Modifikation der SiO2-Schicht mit funktionellen Polymeren und das Einbringen einer Ankergruppe ermöglichen die Festphasensynthese. Darüber hinaus ist die Detektion von biomolekularer Wechselwirkung der fixierten Substanzen mit den zugehörigen Targets mit Hilfe der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie von der Plattenunterseite erlaubt. Durch die Polymerschicht wird die zur Testung notwendige Biokompatibilität gewährleistet

Ein HTS-Phosphorylierungs-Assay mittels Reflektometrischer Interferenzspektroskopie

Die Phosphorylierung ist ein übliches Verfahren zur Charakterisierung von Kinasen und geeigneten Substraten. Für die pharmazeutische Industrie sind neue Verbindungen von Interesse, die in der Lage sind, die Phosphorylierungsaktivität solcher Kinasen zu hemmen. Das Hochdurchsatzscreening hilft bei der Suche nach solchen Inhibitoren. Mit herkömmlichen Methoden wird die Menge des phosphorylierten Proteins bei einer Aktivitätsstudie durch den Einbau von radioaktivem Phosphor bestimmt. Anhand des Ausmaßes der Phosphorylierung kann auf die inhibierende Wirkung der untersuchten Substanzen geschlossen werden. Der Nachweis der Phosphorylierung mit einer markierungsfreien Methode wie der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS) bedeuten den angestrebten Verzicht auf den Umgang mit radioaktiven Isotopen und machen die Markierung als zusätzlichen Arbeits- und Kostenpunkt überflüssig. Die Reflektometrische Interferenzspektroskopie stellt eine neuartige Methode zur markierungsfreien Messung von Interaktionen zwischen ausreichend großen Reaktionspartnern dar. Mit Ihrer Hilfe kann die spezifische Bindung an eine Sensoroberfläche über den Zuwachs der optischen Schichtdickenänderung ausreichend schnell, reproduzierbar und zuverlässig untersucht werden. Dabei besteht mit Hilfe des hier verwendeten Prototyps die Möglichkeit, in einer Mikrotiterplatte 96 Wells simultan zu vermessen und somit ein Screening von Substanzbibliotheken durchzuführen

Markierungsfreie Online-Detektion der Hybridisierung auf einem DNA-Chip : Detektionsmethode für den Gensensor

Die Genomforschung hat sich in den letzten Jahren verstärkt in Richtung neuer analytischer Methoden orientiert, um der großen Anzahl an notwendigen Experimenten durch parallele Ansätze zu begegnen. Der größte Entwicklungsschritt ist hierbei die Verwendung von sogenannten DNA-Chips, womit flächige Arrays aus immobilisierten DNA-Fragmenten beschrieben werden, die zu Anwendungen von der Expressionsanalytik (high density arrays) bis hin zu diagnostischen Chips (low density arrays) herangezogen werden. Die Detektion auf Arrays erfolgt in kommerziellen Geräten in der Regel fast ausschließlich durch Fluoreszenzemission von farbstoffmarkierten Oligonukleotiden an der Oberfläche. In mehreren Beispielen wurde bereits die Detektion der Hybridisierung auf markierungsfreien Biosensoren, jedoch nur in Einkanalmessungen, gezeigt, wie z.B. auf SPR (Biacore), Gitterkoppler oder RIfS (Reflektometrische Interferenzspektroskopie). Diese oberflächenbasierten Detektionsmethoden erfordern keinerlei Markierung der zu detektierenden Komponenten, d.h. es kann im Einzelfall direkt mit Extrakten oder Amplifikaten aus komplexen Matrices heraus gearbeitet werden. Der Schritt der Farbstoffmarkierung entfällt und damit entfällt auch die mögliche Beeinflussung der Wechselwirkung durch die Markierung, genauso wie die Beeinflussung der Fluoreszenzintensität an der Oberfläche durch unspezifische Quenchingefffekte oder auch Photobleaching. Im Bremer Forschungs- und Entwicklungsverbund Gensensorik wird mit dem Ziel einer industriellen Umsetzung des Gensensorik Konzeptes an einer Integration der DNA-Chiptechnologie in ein Gesamtkonzept aus Bioinformatik, biochemischer Fragestellung, Oberflächenchemie, Chipproduktion, Detektion und Datenauswertung/-bewertung gearbeitet. Im Rahmen dieses FuE Verbundeses wird die parallele und zeitaufgelöste Detektion von Hybridisierungsreaktionen an der Oberfläche mittels Reflektometrischer Interferenzspektroskopie auf das Chipformat übertragen

Label Free High-Throughput Screening With Reflectometric Interference Spectroscopy

In Anbetracht der aktuellen Situation bei der Untersuchung und Entdeckung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen war das Ziel der Arbeit eine Untersuchung der Möglichkeiten, die markierungsfreie Detektion für den Einsatz im Hochdurchsatzscreening zu nutzen und durch ein breites Angebot an Sensoroberflächen und Assay-Testformaten ein möglichst breites Anwendungsgebiet zu eröffnen. Als Detektionsmethode wurde die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) verwendet. Das Augenmerk lag zum einen auf der Bereitstellung und experimentellen Charakterisierung von unterschiedlichen Transduceroberflächen, Zum anderen wurde ein für High-Throughput Screening-Anwendungen vorgesehener Prototyp auf seine Eignung hin grundlegend charakterisiert und an unterschiedlichen Beispielassays seine Anwendungsbreite sowie die Grenzen aufgezeigt. Effektive Immobilisierungstechniken, zur kovalenten Immobilisierung von Biotin, (Strept?)Avidin und NTA wurden entwickelt und es wurde gezeigt, dass sich mit diesen Systemen Biotin-Konjugate bzw. His-Tag-Fusionsproteine in unterschiedlicher Dichte auf der Sensoroberfläche immobilisieren lassen, so dass kinetische und thermodynamische Untersuchungen möglich waren. Am Beispiel von drei Assays, die in die Kategorien indirekter Assay, direkter Assay und indirekter funktioneller Assay eingeordnet werden können, wurde gezeigt, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Bindungsstudien für ein HTS auf Basis von markierungsfreier optischer Detektion geeignet sind. Untersucht wurden folgende Assays: 1. indirekter Thrombin-Inhibitor-Bindungsassay 2. direkter Assay zum Screenen einer festphasengebundenen Triazinbibliothek 3. indirekter funktioneller Epidermalwachstumsfaktorrezeptor-Inhibitor-Assay. Mit einer Kavitätendichte von 384 Kavitäten und einer Auswertezeit von unter 15 min wird die parallele RIfS den Anforderungen an Probendurchsätzen gerecht. In Zukunft wird auch eine parallele kinetische Auswertung der Daten möglich sein.Due to the actual development in the search and characterisation of new pharmaceutical drugs, the aim of the presented work was: An evaluation of the possibilities to use label free detection methods in the field of high-throughput screening and to open a wide range of possible applications by offering different sensor surfaces and different assay formats. A prototype to detect the interaction of a receptor with a biosensor surface highly parallel and label free was available. Due to the optical set-up and due to the format of the sample carrier, this prototype was fully compatible with the demands of high-throughput screening HTS. This prototype which was developed and characterized is based on reflectometric interference spectroscopy RIfS. One of the main focuses was to characterize the high-throughput screening prototype with the help of different assay systems. An other focus was to provide and to characterize a set of different sensor surfaces which allow the side directed immobilisation of Ligand for the parallel biomolecular interaction analysis. Effective immobilisation strategies to attach biotin, (strept-)Avidin and NTA covalently onto the sensor surface was developed. With these surfaces it was able to obtain kinetic and thermodynamic data of receptor-ligand interactions. Three screening assays of different type were developed to show the wide range of applications of the set-up: 1.An indirect thrombin-inhibitor binding assay. 2. A direct assay to screen a surface bound, combinatorial triazine library. 3. An indirect functional assay to screen for inhibitors of the epidermal growth factor receptor. With sample carriers to screen up to 384 samples in parallel and a detection time of less than 15 min was shown, that this method is suited for HTS. In the future, there will be also the possibility to evaluate the binding kinetic in parallel