The Molecular Basis for Antigenic Drift of Human A/H2N2 Influenza Viruses.

Influenza A/H2N2 viruses caused a pandemic in 1957 and continued to circulate in humans until 1968. The antigenic evolution of A/H2N2 viruses over time and the amino acid substitutions responsible for this antigenic evolution are not known. Here, the antigenic diversity of a representative set of human A/H2N2 viruses isolated between 1957 and 1968 was characterized. The antigenic change of influenza A/H2N2 viruses during the 12 years that this virus circulated was modest. Two amino acid substitutions, T128D and N139K, located in the head domain of the H2 hemagglutinin (HA) molecule, were identified as important determinants of antigenic change during A/H2N2 virus evolution. The rate of A/H2N2 virus antigenic evolution during the 12-year period after introduction in humans was half that of A/H3N2 viruses, despite similar rates of genetic change.IMPORTANCE While influenza A viruses of subtype H2N2 were at the origin of the Asian influenza pandemic, little is known about the antigenic changes that occurred during the twelve years of circulation in humans, the role of preexisting immunity, and the evolutionary rates of the virus. In this study, the antigenic map derived from hemagglutination inhibition (HI) titers of cell-cultured virus isolates and ferret postinfection sera displayed a directional evolution of viruses away from earlier isolates. Furthermore, individual mutations in close proximity to the receptor-binding site of the HA molecule determined the antigenic reactivity, confirming that individual amino acid substitutions in A/H2N2 viruses can confer major antigenic changes. This study adds to our understanding of virus evolution with respect to antigenic variability, rates of virus evolution, and potential escape mutants of A/H2N2

On State-Space Reduction in Multi-Strain Pathogen Models, with an Application to Antigenic Drift in Influenza A

Many pathogens exist in phenotypically distinct strains that interact with each other through competition for hosts. General models that describe such multi-strain systems are extremely difficult to analyze because their state spaces are enormously large. Reduced models have been proposed, but so far all of them necessarily allow for coinfections and require that immunity be mediated solely by reduced infectivity, a potentially problematic assumption. Here, we suggest a new state-space reduction approach that allows immunity to be mediated by either reduced infectivity or reduced susceptibility and that can naturally be used for models with or without coinfections. Our approach utilizes the general framework of status-based models. The cornerstone of our method is the introduction of immunity variables, which describe multi-strain systems more naturally than the traditional tracking of susceptible and infected hosts. Models expressed in this way can be approximated in a natural way by a truncation method that is akin to moment closure, allowing us to sharply reduce the size of the state space, and thus to consider models with many strains in a tractable manner. Applying our method to the phenomenon of antigenic drift in influenza A, we propose a potentially general mechanism that could constrain viral evolution to a one-dimensional manifold in a two-dimensional trait space. Our framework broadens the class of multi-strain systems that can be adequately described by reduced models. It permits computational, and even analytical, investigation and thus serves as a useful tool for understanding the evolution and ecology of multi-strain pathogens

[Antigene en moleculaire surveillance van influenzavirusstammen in de periode 1990-1992.]

Abstract niet beschikbaarInfluenza virus is subject to frequent antigenic changes. As a consequence, the World Health Organization (WHO) operates a world-wide laboratory network to monitor these changes. RIVM participates in this system. It isolates influenza virus strains from clinical specimens obtained from a sentinel station network of general practitioners. It also compares Dutch virus strains with foreign virus strains and with the virus strains used in the current influenza vaccine. The results are reported to the WHO and to the Ministry of Health of the Netherlands. The results of such comparisons enable the Dutch health authorities to consider adaptations of the WHO-proposal about the vaccine for the next season to the epidemiological situation in the Netherlands. A total of 256 influenza A virus strains isolated in 1990-1992 in the Netherlands and other countries were analysed by haemagglutination-inhibition (HI) tests using ferret antisera and monoclonal antibodies and, partly, by determination of the nucleotide sequences of the haemagglutinin gene (HA1). In the season 1991/92, most strains belonged to the subtype A(H3N2), a minority to the subtype A(H1-N1). The overall antigenic structure was similar to that of the corresponding vaccine strain for both subtypes. This means that the influenza vaccine will have rendered optimal protection against the circulating virus strains in 1991/92. A markedly heterogeneous geographic distribution was noted with the two most frequently isolated HI-variants of subtype A(H3N2). One prevailed in the Netherlands and in Spain, the other in Sweden, France, and the United States. Even within the Netherlands the proportions of the two variants showed regional variation. This heterogeneity did not have implications for the vaccine efficacy.GH

[Antigene en moleculaire influenza virus surveillance 1992-1993.]

Abstract niet beschikbaarIn the framework of the influenza virus surveillance of RIVM we have examined 195 influenza virus strains isolated in various European countries and Japan during the season 1992/93. Haemagglutination inhibition (HI) assasys showed the H3N2-virus strains to come into two groups of roughly equal sizes. One group was similar to the strains circulating in 1991/92, including the vaccine strain of the season 1992/93, whereas the other group belonged to a new variant, typified by strain A/Beijing/32/92. The antigenic difference between the two groups was unusually large for two contemporary variants of H3N2-virus. This implicates that people, even when infected with influenza virus A (H3N2) in 1991/92 or vaccinated in November 1993, were poorly protected against the new virus variant. Probably this explains the high number of excess deaths (1800) that was observed in the Netherlands early in 1993. Interestingly, antigenic as well as molecular analysis demonstrated a relationship between the new virus variant and sporadically circulating deviant H3N2-viruses from Chine, Singapore, and France isolated in 1990 and early 1991. During the epidemic, in the Netherlands two other H3N2-virus strains were isolated which apparently originated from pigs. The numerous influenza B virus strains and the few Influenza A (H1N1) virus strains isolated in 1992/93 well matched the respective vaccine strains used in this season.GH

Antigene surveillance van influenzavirus in de periode 1995-1996

Het influenzavirus ondergaat frequente antigene veranderingen die jaarlijkse aanpassing van het influenzavaccin door de WHO noodzakelijk maken. Voor dit doel genereert, verzamelt en analyseert het Nationaal Influenza Centrum (NIC, een samenwerkingsverband van het RIVM met de Erasmus Universiteit Rotterdam) in Nederland bij huisarts- en ziekenhuispatienten geisoleerde influenzavirusstammen. Het NIC vergelijkt deze stammen met de gebruikte vaccinstammen en met andere buitenlandse stammen. In zowel Nederland als elders in Europa was de influenzaepidemie van 1995/96 vroeg en van een gemiddelde omvang. Het subtype A(H3N2) overheerste maar ook A(H1N1)- en B-virussen werden gerapporteerd. De hoofdvarianten uit de seizoenen 1995 (zuidelijk halfrond) en 1995/96 (noordelijk halfrond) bleken in antigeen opzicht bij alle drie (sub)typen weinig of niet af te wijken van die uit 1994 en 1994/95, of van de gebruikte vaccinstammen. Zowel de immuniteit verworven door vroegere infecties als die opgewekt door vaccinatie zullen derhalve relatief goede bescherming hebben geboden tegen infectie met influenzavirus in 1995/96.As a consequence of frequent antigenic changes of the virus, the composition of the influenza vaccine is annually adapted by WHO. In this framework, the National Influenza Centre (NIC, a collaboration of RIVM with the Erasmus University Rotterdam) generates and collects influenza virus strains isolated in the Netherlands from patients presenting to general physicians and in hospitals. NIC compares these strains with the vaccine strains recommended by WHO and with other foreign strains. In Europe, including the Netherlands, the influenza epidemic of 1995/96 was early and of an average extension. Subtype A(H3N2) dominated but A(H1N1) and B-viruses were also reported. The antigenic reactivities of the three major influenza virus variants of the seasons 1995 (southern hemisphere) and 1995/96 (northern hemisphere) did not differ significantly from those of the seasons 1994 and 1995/96, or from the vaccine strains used in the 1995/96 season. Therefore, both the infection-acquired and the vaccine-induced immunity will have rendered a relative good protection against influenza virus infections in 1995/96.IG

Virological NIVEL/RIVM-surveillance of respiratory virus infections in the season 1995/96

Het doel van de NIVEL/RIVM-surveillance van respiratoire virusinfecties is de microbiologische oorzaken van acute respiratoire aandoeningen (ARA) op te helderen bij patienten die hun huisarts raadplegen. De basis vormen de 65 'peilstationartsen' die deelnemen aan de registratie van influenza-achtige ziektebeelden (IAZ) door het NIVEL (Nederlands Instituut voor Onderzoek van de Gezondheids-zorg). Sinds het seizoen 1992/93 sturen zij in het respiratoire seizoen neus-/keelwatten op van door hen behandelde patienten met acute luchtwegklachten naar het RIVM. Op dit instituut worden deze specimens onderzocht op de aanwezigheid van virussen door middel van viruskweek. Deze surveillance verschaft betere informatie over de oorzaken van ARA bij de algemene bevolking dan de uitslagen van de virusdiagnostische laboratoria, die het meeste van hun materiaal verkrijgen van ziekenhuispatienten. In september werd een verhoging van het percentage positieve monsters gezien, samenvallend met de opening van de scholen eind augustus. Uit de meeste van deze monsters werd een rhinovirus ge-isoleerd. In combinatie met buitenlandse gegevens over een verhoogde incidentie van ARA wijst deze waarneming op een toename in september van infectieuse ARA in deze periode. De influenzaepidemie van 1995/96 begon vroeg en was van een matige omvang. In Nederland en in vele andere landen overheerste het influenza A(H3N2) virus.The purpose of the NIVEL/RIVM surveillance of respiratory virus infections is to clarify the etiology of acute respiratory illnesses (ARI) at the level of patients who consult their family doctor. Since the season of 1992/93, the general practitioners (GPs) participating in the nation-wide sentinel network of the Netherlands institute of primary health care (NIVEL) sent nose/throat swabs from their patients with ARI to the RIVM. At RIVM, these swabs were examined for the presence of viruses by virus culture. This surveillance provides more accurate information on the etiology of ARI in the general population than the results of the diagnostic laboratories, which are mainly dealing with specimens from hospitalised patients. A temporary increase of the rate of positive samples - especially yielding rhinoviruses - was noted in September, coinciding with the opening of schools at the end of August. The influenza epidemic of the season of 1995/96 started early and was of a moderate size. In the Netherlands and in a number of other countries, subtype A(H3N2) virus predominated.IG

[Virological NIVEL/RIVM-surveillance of respiratory virus infection in the season 1993/94.]

Abstract niet beschikbaarIn the season 1993/94 the virological NIVEL (Netherlands institute of primary health care)/RIVM-surveillance of respiratory virus infections was continued. The sentinel general physicians participating in the NIVEL network submitted 298 samples from patients with respiratory complaints From 92 (31%) of the samples a respiratory virus was grown, 67 of which were influenza A (H3N2) viruses. The antigenic reactivity of the strains in haemagglutination inhibition tests corresponded well with the virus isolates from diagnostic laboratories. When calculated per 10,000 persons, most influenza viruses were obtained from children aged 5-14 years. This is at variance with the NIVEL registration of influenza-like illnesses, which showed the highest incidence in the age group of 0-4 years. The protective effect of influenza vaccination over the seasons 1991/92, 1992/93, and 1993/94 was estimated at 76%.GH

Antigene en moleculaire surveillance van influenzavirus in de periode 1993-1994

Het influenzavirus ondergaat frequente antigene veranderingen die jaarlijkse aanpassing van het influenzavaccin noodzakelijk maken. Voor dit doel coordineert de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) een mondiaal netwerk van virologische laboratoria. In dit kader vormen de Erasmus Universiteit Rotterdam (EUR) en het RIVM tezamen het Nationaal Influenza Centrum (NIC) voor Nederland. De EUR verzamelt recente influenzavirustammen uit de Nederlandse diagnostische laboratoria, analyseert deze met serologische en moleculaire technieken, vergelijkt deze met referentiestammen en met de door de WHO voorgestelde vaccinstammen en zendt de stammen naar de WHO. Het RIVM voert in samenwerking met NIVEL een surveillance van respiratoire virusinfecties uit. De hieronder geisoleerde influenza-virusstammen worden eveneens onderzocht met serologische en moleculaire technieken en naar de WHO verzonden. Bovendien verzamelt en analyseert het RIVM influenzavirusstammen uit het buitenland en vergelijkt deze met de Nederlandse stammen. In de seizoenen 1993 (zuidelijk halfrond en de tropische landen) en 1993/94 (gematigde streken van het noordelijk halfrond) werden door het RIVM 207 influenzavirusstammen geanalyseeerd uit respectievelijk Singapore, Australie, Nieuw Zeeland, Hong Kong, Zuid-Afrika, Zweden, Noorwegen, Engeland, Frankrijk, Spanje en Nederland. Het betrof in 195 gevallen het subtype A(H3N2) en in 12 gevallen het type B. De H3N2-virusstammen behoorden alle tot de nieuwe groep varianten, waarvoor het A/Beijing/32/92-virus de referentiestam is. Deze groep circuleerde ook al op kleine schaal in de eerste helft van 1993 met ongeveer dezelfde antigene eigenschappen. De in 1993/94 in Nederland geisoleerde virusstammen waren serologisch gelijk aan die uit het buitenland. Ze konden in drie varianten worden onderverdeeld. De hoofdvariant maakte 95% van het totale stammen uit. Deze variant verschilde sterk van de hoofdvariant van de epidemie van 1991/92 en ontmoette, omdat de H3N2-epidemie van 1992/93 beperkt van omvang was geweest, slechts betrekkelijk weinig specifieke weerstand onder de bevolking. Dit droeg waarschijnlijk bij tot de hoge extra mortaliteit van circa 6200 gevallen die het Centraal Bureau voor de Statistiek voor Nederland in de laatste maanden van 1993 registreerde. Een andere factor hierbij zal zijn geweest dat de antigeenstructuur van het vaccinvirus A/Beijing/32/92 enige mate afweek van de bovengenoemde in Nederland en elders in 1993 en 1994 circulerende hoofdvariant van het H3N2-virus. Vermoedelijk heeft het vaccin daardoor in het seizoen 1993/94 geen optimale bescherming tegen influenza geboden.In order to formulate recommendations for the annual review of the influenza vaccine composition, the World Health Organization (WHO) coordinates a global network of virological laboratories. In this framework, the Erasmus University of Rotterdam (EUR) and RIVM together form the National Influenza Centre (NIC) of the Netherlands. EUR collects recent influenza virus strains isolated in the Dutch diagnostic laboratories, analyses them by serological and molecular methods, compares them with reference strains and with the vaccine strains proposed by WHO, and sends them to WHO. RIVM isolates influenza viruses in the NIVEL/RIVM surveillance of respiratory virus infections, sends them to WHO, and collects recent influenza virus strains from abroad. At RIVM, the foreign strains are examined with serological and molecular methods and compared with the Dutch virus strains. Of the seasons 1993 (southern hemisphere and tropical countries) and 1993/94 (temperate areas of the northern hemisphere), the influenza epidemics were almost exclusively caused by subtype A(H3N2). Of this period, 207 influenza virus strains originating from Singapore, Australia, New Zealand, Hong Kong, South Africa, Sweden, Norway, United Kingdom, France, Spain, and the Netherlands were analyzed. Of this collection, 195 strains belonged to subtype A(H3N2) and 12 to type B. All the H3N2 virus strains were related to the vaccine strain n/Beijing/32/92. This lineage of strains dates back to the sporadically circulating H3N2 virus strains of 1990. In this report a detailed picture is presented of the antigenic and molecular evolution of this lineage and of another, now (perhaps temporarily) extinct lineage. In 1993/94, we could distinguish three antigenic variants of A/Beijing/32/92-like H3N2 viruses. The main variant comprised 95% of the total number of tested strains. Haemagglutination inhibition (HI) tests indicated that this variant differed widely from the main variant of the previous large epidemic of H3N2 virus (1991/92), implying that the existing group immunity to this variant was very low in the human population. This may have contributed to the high excess mortality of 6200 cases registered during the influenza epidemic of 1993/94. The main variant was related to the 1993/94 vaccine strain A/Beijing/32/92. Still, the differences observed in HI assays suggest that the vaccine induced a less - than - optimal protection against influenza during the last season. With regard to influenza B virus, no significant antigenic changes could be detected when comparing the 1993/94 strains with the strains of 1990/91 and 1992/93.GH

Antigene en moleculair-biologische surveillance van influenza in de periode 1994-1995

Het influenzavirus ondergaat frequente antigene veranderingen die jaarlijkse aanpassing van het influenzavaccin noodzakelijk maken. Voor dit doel coordineert de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) een mondiaal netwerk van virologische laboratoria. In dit kader vormen de Erasmus Universiteit Rotterdam (EUR) en het RIVM tezamen het Nationaal Influenza Centrum (NIC) voor Nederland. De EUR verzamelt recente influenzavirusstammen uit de Nederlandse diagnostische laboratoria, analyseert deze met serologische en moleculaire technieken, vergelijkt deze met referentiestammen en met de door de WHO voorgestelde vaccinstammen en zendt de stammen naar de WHO. Het RIVM voert in samenwerking met NIVEL een surveillance van respiratoire virusinfecties uit. De hieronder geisoleerde influenzavirusstammen worden eveneens onderzocht met serologische en moleculaire technieken en naar de WHO verzonden. Bovendien verzamelt en analyseert het RIVM influenzavirusstammen uit het buitenland en vergelijkt deze met de Nederlandse stammen. In heel Europa behalve Zwitserland was de influenza-epidemie van 1994/95 laat en klein. Stammen van influenzavirus B, A(H3N2) en A(H1N1) circuleerden naast elkaar. Uit de seizoenen 1994 (zuidelijk halfrond), 1994/95 en 1995 werden 84 stammen van het type B, 82 van A(H3N2) en 16 van A(H1N1) onderzocht. De hoofdvariant van het B-virus uit 1994/95 verschilde in antigeen opzicht significant zowel van de hoofdvariant uit de vorige epidemie van 1992/93 als van de vaccinstam die in 1994/95 werd gebruikt. Noch de immuniteit verworven door infectie, noch die opgewekt door vaccinatie zullen derhalve optimale bescherming hebben geboden tegen infectie met type B in 1994/95. De voornaamste variant van het A(H3N2)-virus in 1994/95 evenwel verschilde in antigeen opzicht niet van die in de vorige epidemie van 1993/94, noch van de vaccinstam voor 1994/95. Zowel de natuurlijk verkregen immuniteit als de influenzavaccinatie zullen dus optimaal hebben beschermd tegen infectie met A(H3N2) virus in 1994/95. De A(H1N1) virusstammen uit 1994/95 weken evenmin af van die uit vorige jaren of van de in 1994/95 toegepaste vaccinstam. Bij vergelijking van de antigene eigenschappen en de RNA-nucleotidensequenties van de Nederlandse influenzavirusstammen van 1994/95 met die uit het buitenland werden geen verschillen van betekenis gevonden tussen deze twee groepen. In onze studie hebben wij onder de influenzavirusisolaten uit Oost-Azie uit 1995 geen nieuwe variant aangetroffen. In het licht van de gegevens gepresenteerd in dit rapport lijkt het advies van de WHO voor de vaccinsamenstelling voor 1995/96 adequaat.In order to formulate recommendations for the annual review of the influenza vaccine composition, the World Health Organization (WHO) coordinates a global network of virological laboratories. In this framework, the Erasmus University of Rotterdam (EUR) and the National Institute of Public Health and the Environment (RIVM) together form the National Influenza Centre (NIC) of the Netherlands. EUR collects recent influenza virus strains isolated in the Dutch diagnostic laboratories, analyses them using haemagglutination inhibition (HI) assays and RNA sequencing, compares them with reference strains and with the vaccine strains proposed by WHO, and then sends them to the WHO. RIVM isolates influenza viruses in the NIVEL/RIVM surveillance of respiratory virus infections, analyses them, like EUR, using HI tests and RNA sequencing, sends them to WHO, and collects recent influenza virus strains from abroad. At RIVM, the foreign strains (including the WHO vaccine strains) are examined using the same methods mentioned above and compared with the Dutch virus strains. Throughout Europe, except for Switzerland, the influenza epidemic of 1994/95 was unusually small and late. Strains of influenza virus B, A(H3N2), and A(H1N1) cocirculated. From both hemispheres a total of 84 strains of B virus, 82 of A(H3N2) virus, and 16 of A(H1N1) virus from the seasons 1994, 1994/95, and 1995 were examined. In antigenic respect, the major B virus variant of 1994/95 significantly differed from the major variant of the previous B virus epidemic in 1992/93 and from the vaccine strain used in 1994/95. Neither the immunity resulting from natural infection nor that induced by the vaccine will therefore have offered optimal protection against B virus infection in 1994/95. The major A(H3N2) virus variant of 1994/95 did not significantly differ in antigenic respect from the major variant of the previous A(H3N2) virus epidemic in 1993/94 or from the vaccine strain used in 1994/95. Both the immunity acquired by infection in 1993/94 and that induced by the influenza vaccine will, therefore, have rendered optimal protection against A(H3N2) virus infection in 1994/95. No antigenic drift or deviation from the vaccine strain was observed in the A(H1N1) virus strains isolated in 1994/95. When comparing the influenza virus strains from the Netherlands with foreign strains from the 1994/95 season, using HI tests and RNA sequencing, no significant differences were found between these two groups of strains. Further, a new variant among the influenza virus strains from East Asia which were isolated in 1995 has not been detected. In view of the data presented in the present report, the recommendations of WHO for the season 1995/96 seem appropriate.IG

Virologische NIVEL/RIVM-surveillance van respiratoire virusinfecties in het seizoen 1996/97

Het doel van de surveillance van respiratoire virusinfecties van het Nederlands Instituut voor Onderzoek van de Gezondheidszorg (NIVEL) en het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM) - is het vaststellen van de incidentie van acute respiratoire virusinfecties (ARI) bij patienten die hun huisarts raadplegen wegens een ARI. Voor dit doel zenden huisartsen van het NIVEL-netwerk van huisartspeilstations sinds het seizoen 1992/93 van een selectie van hun ARI-patienten neus-keeluitstrijken naar het RIVM. Op het RIVM worden deze onderzocht op de aanwezigheid van virussen door kweek en, in de seizoenen 1994/95 en 1996/97, ook door polymerase chain reaction (PCR) detectie-methoden op bepaalde virussen, Mycoplasma pneumoniae of Chlamydia pneumoniae. In 1996/97 werd een deel van de patienten tevens onderzocht op conventionele bacterien.In 64% van de 540 onderzochte monsters werd een virus (55%) of bacterie (16%) aangetoond. Het vaakst werd influenzavirus (24%) aangetroffen, op de voet gevolgd door rhinovirus (22%). Evenals in voorgaande jaren werd in september 1996 een verhoogd percentage positieve monsters waargenomen. Deze verhoging viel samen met de aanvang van het nieuwe schooljaar. De influenzaepidemie begon half december 1996 en was normaal wat betreft omvang en duur. De epidemie begon met een golf van influenza subtype A(H3N2), in de weken 4 - 9 gevolgd door een kleine, overlappende golf van type B. Bij de huisartspatienten was 61% van de isolaten subtype A(H3N2), bij de isolaten van de virusdiagnostische laboratoria 88%. Dit verschil is een jaarlijks terugkerend verschijnsel en waarschijnlijk het gevolg van de hogere pathogeniteit van subtype A(H3N2) vergeleken met type B. Berekend over de seizoenen 1992/93 tot en met 1996/97 werd een influenza-virus gekweekt bij tenminste 26% van de IAZ geregistreerd door het NIVEL. Over dezelfde periode ontwikkelde per seizoen gemiddeld naar schatting 2.7% van de Nederlandse bevolking een IAZ veroorzaakt door dit virus. Door de huisartsen van het NIVEL werd een IAZ het vaakst gezien bij kinderen van 0-4 jaar oud. Na correctie voor het percentage monsters waaruit een influenza-virus werd gekweekt en voor de fractie IAZ-patinten die de huisarts raadpleegt blijkt echter dat de influenzaincidentie het hoogst is bij 5-14 jarigen, nl 5,3%. Influenza kwam het meeste voor op het - naar het volksgeloof zo "gezonde" - platteland. De noordelijke regio werd het minst getroffen door deze ziekte.The purpose of the Netherlands Institute of Primary Health Care (NIVEL)/National Institute of Public Health and the Environment (RIVM) surveillance is to establish the incidence of acute respiratory virus infections (ARI) in patients who consult their family doctor with ARI complaints. Since the 1992/93 season, the general practitioners (GPs) of the NIVEL network have been sending nose-throat swabs for this purpose from a selection of ARI patients to the RIVM. At the RIVM, these swabs were examined using virus culture, and in the 1994/95 and 1996/97 seasons, also polymerase chain reactions (PCR) for the detection of selected viruses, Mycoplasma pneumoniae (Mp) and Chlamydia pneumoniae (Cp). In the 1996/97 season, some of the patients were also examined for conventional bacteria. A potentially respiratory pathogenic agent was detected using culture and/or PCR in 64% of the 540 examined specimens. Viruses were found in 55% and conventional bacteria in 16% of the samples. Influenza virus, cultured from 24% of the samples, was the predominant virus, followed by rhinovirus (22%), respiratory syncytial (RS) virus (5%), and enterovirus (4%). As in previous years, a temporary increase in the rate of positive samples - especially those containing rhinoviruses - was noted in September, coinciding with the opening of schools at the end of August. In the Netherlands, the influenza epidemic of the 1996/97 season started in the second half of December and had the usual size and length. The epidemic began with a major wave of subtype A(H3N2) virus infections, followed by a small overlapping wave of type B virus infections in weeks 4 - 9. Sixty-one percent of the influenza viruses isolated from GP patients were H3N2, while 88% of those isolated in diagnostic laboratories were this subtype. In fact, this is a yearly recurring phenomenon and probably reflects the higher pathogenicity of subtype A(H3N2), compared with type B. Over the five seasons studied, influenza virus infections accounted for at least 26% of the ILI registered by NIVEL. Calculated over the same five seasons, an estimated 2.7% of the Dutch population developed per season an ILI caused by an influenza virus infection. According to the ILI registration, the highest incidence of ILI occurred among 0 to 4-year-old children. After correction for the influenza virus isolation rate and the fraction of ILI patients who consulted their GP, however, the highest incidence of influenza, 5.3%, occurred among the 5 to 14-year olds. Influenza occurred most frequently in the (according to popular belief 'healthy') countryside and least frequently in the northern region of the Netherlands.IG