Expression of adaptor protein Ruk/CIN85 isoforms in cell lines of various tissue origins and human melanoma

Aim: Development of monoclonal and polyclonal antibodies against recombinant GST-fused proteins including correspondingly N- and C-terminal parts of Ruk/CIN85 adaptor protein. Analysis of Ruk/CIN85 expression patterns in cell lines of various tissue origins and human melanoma. Methods: Recombinant GST-fused fragments of Ruk/CIN85 were expressed in bacterial system and affinity purified. Monoclonal antibodies against SH3A domain of Ruk/CIN85 were produced using hybridoma technique. The specificity of generated antibodies was examined by ELISA. Polyclonal antibodies against C-terminal coiled-coil region of Ruk/CIN85 were affinity purified from serum of immunized rabbit. Expression patterns of Ruk/CIN85 isoforms and their subcellular localization in cell lines of various tissue origins and human melanoma samples were analyzed by immunoblotting, immunoprecipitation and immunofluorescence microcopy. Results: Ruk/CIN85 is ubiquitously expressed SH3-containing adaptor/scaffold protein which plays important roles in signalling processes. N-terminal half of Ruk/CIN85 molecule, including three SH3 domains, and its C-terminal coiled-coil region were used as antigens to produce monoclonal and polyclonal antibodies, respectively. Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies (mAbs) to SH3 fragment of Ruk/CIN85 were established. One of the mAbs was extensively characterized and designated as MISh-A1. It was shown that this mAb recognizes an epitope, which resides within first SH3A domain. Polyclonal anti-Ruks Abs affinity purified from serum of immunized rabbit specifically recognized main Ruk/CIN85 isoforms, both endogenous and recombinant, in lysates of HEK293 cells. Notably, produced Abs did not cross-react with CD2AP, the member of the same family of adaptor/scaffold proteins. Multiple molecular forms of Ruk/CIN85 with apparent molecular weights of 130, 80–85, 70–75, 50–56, 34–40 and 29 kD were detected in cell lyzates of NIH3T3, Cos1, L1210, HEK293, Ramos, HeLa S3, MDCK, C6, A549 and U937 using anti-Ruk antibodies. Oligomerization between p85 and p50–56 forms of Ruk/CIN85 was revealed in C6 and NIH3T3 cells, but not in HeLa S3 and HEK293 cells by immunoprecipitation using MISh-A1 antibody following anti-Ruk Western-blot analysis. Using immunofluorescent microscopy and anti-Ruk antibodies, endogenous Ruk-variates were found mostly in cytoplasm of C6, NIH3T3, HEK293 cells and at lower level — in nuclei. Conclusion: Patterns of Ruk/CIN85 molecular forms expression are cell-specific and determined by cellular context. Assembly of oligomeric complexes between p85 and p50–56 Ruk/CIN85 isoforms in C6 and NIH3T3 cells but not in HeLa S3 and HEK293 cells may reflect their specific biological roles in different cell lines. High level of full-length Rukl/CIN85 form expression was revealed in extracts of human melanoma samples. Abs described in this paper may prove useful in future studies of Ruk/CIN85 expression and function in normal and transformed cells.Цель: получение моноклональных и поликлональных антител против рекомбинантных GST-коныогированных форм белков, включающих соответственно N-концевую и С-концевую части адаптерного белка Ruk/CIN85. Авалю профилей экспрессии изоформ Ruk/CIN85 и юс субклеточной локализации в клеточных линиях различного тканевого проасхождешя н образцах меланомы человека. Методы: рекомбинантные GST-конъюгнрованные фрагменты Ruk/CIN85 (GST-3SH3/CIN85 и GST- Ruk ) экспрессировали в бактериальной системе с последующей аффинной очисткой на глутатнон-сефарозе. Для получения моноклональных антител против 3SH3 фрагмента С IN85 использовали гнбридомную технологию. Поликлоналыеле антитела против С-конневого суперсинралнзоваииого района Ruk очищали из сыворотки иммунизированного кролика аффинной хроматографией на Ruk -сефарозе. Профази экспрессии изоформ Ruk/CTN85, их олигомеризацию и субклеточную локализацию изучали метолами Вестерн-блотанализа, нммувопрецнпнгацнн и иммунофлуоресиентной микроскопии. Результаты: Ruk/CIN85, S НЗ-содержащий адаптерный “стеллажный” белок, преет важную роль в сшив мытых процессах клеток. N- конневую часть молекулы CIN85, включающую 3 SH3 домена, н С-конценой суперспирализокаиный райе» использовали в качестве антигенов для получения моноклональных и нолик.тональных антител, соответственно. Получены гибрнломы. секретнру юнше моноклональные антитела к 3SH3-фрагменту. Показано, что одно из этих антител (MISh-Al) специфически узнает эпитоп, находящийся в первом $НЗАдомеие адаптерного белка. Поликлональные анти-Ruk антитела, аффинно очищенные из сыворотки иммунизированного кроля, снецифическм узнавати основные изоформы Ruk/CIN85, как эндогенные, так и рекомбинантные, в лизатах клеток НЕК293. Важно, что полученные антитела не реагировази перекрестно с CD2AP, представителем этого же семейства атаптерных белков. Множественные молекулярные формы Ruk/CIN85 с кажущейся молекулярной массой 130. 80-85, 70-75, 50-56, 34-40 and 29 кДа были детектированы в лизатах клеток NIH3T3, Cost, 1.1210, НЕК293, Ramos, HeLa S3, MDCK, Сб, A549 и U937 с Rak антител. Олигомеризацию между р85 и р50-56 формами Ruk/CIN85 выявили в клетках С6 и NIH3T3, во не в HeLa S3 и НЕК293, с помощью антитела MISh-AI и последующего анги-Rak Вестерн-блот анализа. Иммунофлу оресиентной микроскопией с использованием анти-Ruk антител эндогенные варианты Ruk выявляли прешущественно в цитоплазме клеток С6, NIH ЗТЗ, НЕК293 и в более низкой степени в ядре. Высокий уровень экспресс» полноразмерной формы RA/C1N85 выявлен в образцах меланомы человека. Выводы: профили экспрессии множественных эндогенных вариантов Ruk/CIN85 и способность к формированию олигомерных комніексов между различными и зоформами являются характерными для каждой исследованной линии клеток. Не исключено, что выявленные особенности могут определять специфическую биологическую значимость изоформ Ruk/CEN85 в различных типах клеток в зависимости от клеточного контекста. Следствием высокого уровня экспрессии полноразмерной формы Rnk/CIN85 в образцах меланомы человека может быть нарушение согласованного контроля процессов пролиферации и апоптоза в трансформированных ме.таноцитах. Антитела, описанные в этой работе, могут быть использованы для изучения экспрессии и функций Ruk/CIN85 в опухолях человека

Iron Behaving Badly: Inappropriate Iron Chelation as a Major Contributor to the Aetiology of Vascular and Other Progressive Inflammatory and Degenerative Diseases

The production of peroxide and superoxide is an inevitable consequence of aerobic metabolism, and while these particular "reactive oxygen species" (ROSs) can exhibit a number of biological effects, they are not of themselves excessively reactive and thus they are not especially damaging at physiological concentrations. However, their reactions with poorly liganded iron species can lead to the catalytic production of the very reactive and dangerous hydroxyl radical, which is exceptionally damaging, and a major cause of chronic inflammation. We review the considerable and wide-ranging evidence for the involvement of this combination of (su)peroxide and poorly liganded iron in a large number of physiological and indeed pathological processes and inflammatory disorders, especially those involving the progressive degradation of cellular and organismal performance. These diseases share a great many similarities and thus might be considered to have a common cause (i.e. iron-catalysed free radical and especially hydroxyl radical generation). The studies reviewed include those focused on a series of cardiovascular, metabolic and neurological diseases, where iron can be found at the sites of plaques and lesions, as well as studies showing the significance of iron to aging and longevity. The effective chelation of iron by natural or synthetic ligands is thus of major physiological (and potentially therapeutic) importance. As systems properties, we need to recognise that physiological observables have multiple molecular causes, and studying them in isolation leads to inconsistent patterns of apparent causality when it is the simultaneous combination of multiple factors that is responsible. This explains, for instance, the decidedly mixed effects of antioxidants that have been observed, etc...Comment: 159 pages, including 9 Figs and 2184 reference

Control of urea hydrolysis and nitrification in soil by chemicals - Prospects and problems

A review is made of the recent work to assess the prospects of regulating urea hydrolysis and nitrification processes in soils by employing chemicals that can retard urea hydrolysis and nitrification. The possible benefits from control of nitrogen transformations in terms of conserving and enhancing fertilizer nitrogen efficiency for crop production and the problems associated with their use with regard to N metabolism of plants have also been discussed with examples. Prospects of using cheap and effective indigenous materials and chemicals for control of urea hydrolysis and nitrification under specific soil situations appear eminent in improving the fertilizer nitrogen efficiency. Urease inhibitors may be helpful in reducing problems associated with ammonia volatilization if this is not offset by leaching of urea. On the other hand retardation of nitrification appears useful in reducing losses that accompany nitrification due to leaching and denitrification, and with the plants that metabolize equally well with relatively higher amounts of NH4–N may be more effective in improving the utilization of fertilizer N under these situation

New Media Ecology and Theoretical Foundations for Nonfiction Digital Narrative Creative Practice

Digital storytelling techniques and persuasive communications are becoming increasingly intertwined and realized in cultural discourses such as cultural heritage, environmental activism, and politics. Rhetorical theory has grounded and influenced communication practice since the age of oration, and as society is increasingly undergoing new mediatization, digital rhetorical theory can be reexamined and applied to nonfiction digital narratives for improved practice. Narratology provides key theoretical foundations that are braided into digital rhetoric for application to digital nonfiction narratives. This article highlights how new media has changed the impacts of the modes of persuasion (ethos, pathos, logos, and kairos) on today's multimedia-consuming audiences and how the classical rhetorical canons (invention, arrangement, style, delivery, and memory) can be reframed and updated by incorporating narrative theory to aid creators of new nonfiction digital narratives across different genres

МЕТОД РОЗВ’ЯЗАННЯ КОМПЛЕКСНОЇ ОПТИМІЗАЦІЙНОЇ ЗАДАЧІ ФОРМУВАННЯ СКЛАДУ КОЛОНИ ТЕХНІКИ ТА ВИБОРУ МАРШРУТУ ЇЇ РУХУ ПО НЕСТАЦІОНАРНІЙ МЕРЕЖІ ДОРІГ

Context. Effective solution of a number of application problems related to transportation, as a rule, depends on the solution of two problems: the correct formation of the composition of the column of technique and the successful choice of the route of its movement. Each of the problems is optimization, the methods of solving which are currently being worked out. Theoretical studies of each of the individual problems and their practical applications indicate their interdependence, which has not yet been fully studied. Practical applications necessitate the development of a suitable scientific and methodological apparatus.Objective. The purpose of this work is development of a method for solving a complex optimization problem of forming a column of vehicles and choosing the route of its movement on a non-stationary road network.Method. The mathematical model of solving the optimization problem of complex formation of the composition of the column of machinery and the choice of its route of motion is proposed. A heterogeneous set was used to describe the array from which the vehicles were selected. A graph was used to describe the road network. As a criterion for the optimality of the complex problem is the minimization of time spent on moving. The peculiarity of the model is to take into account the possibility of dynamically changing the time weights of edges of the graph when implementing the movement of a column of machinery along the chosen route. Based on the use of this model, a method is proposed, which provides a comprehensive choice of the composition of the column of equipment and optimal routes of its movement on a non-stationary road network.Results. The article proposes an algorithm that provides the solution of the optimization problem of complex formation of the composition of machinery column and the choice of its route of motion in terms of time-fixed edges that describe the network of roads. The features of application of the proposed algorithm are given. Using the developed software, the choice of technique from an existing inhomogeneous array and the choice of a route on a graph with a non-stationary time weight of edges was investigated. The example shows the imperfection of decisions regarding the complex formation of the column composition and the choice of its optimal route of travel on a non-stationary network of roads obtained using classical methods.Conclusions. Not taking into account the impact of a possible change in traffic conditions, as evidenced by a change in the time weights of the edges of the graph describing the road network, on the composition of the column of machinery can lead to suboptimality of the obtained solutions using classical methods of forming the composition of the column and finding the shortest route in the graph. The method proposed in this study can be used to obtain the optimum composition of the column and the route, taking into account the change in road conditions during the movement of the column. The obtained results extend the possibilities of the theory of discrete optimization and the theory of graphs.Актуальность. Эффективное решение ряда прикладных задач, касающихся перевозок, как правило, зависит от решения двух задач: корректного формирования состава колонны техники и удачного выбора маршрута ее движения. Каждая из задач является оптимизационной, методы решения которых в настоящее время определены. Теоретические исследования каждой из отдельных задач и их практические применения указывают на их взаимозависимость и взаимообусловленность, что еще не до конца изучено. Практические применения обусловливают необходимость развития соответствующего научно-методического аппарата.Цель. Целью работы является разработка метода решения комплексной оптимизационной задачи формирования состава колонны техники и выбора маршрута ее движения по нестационарной сети дорог.Метод. В работе предложена математическая модель решения оптимизационной задачи комплексного формирования состава колонны техники и выбора ее маршрута движения. Для описания массива, с которого осуществляется выбор транспортных средств, использовано неоднородное множество. Для описания сети дорог использован граф. В качестве критерия оптимальности комплексной задачи выступает минимизация времени, которое тратится на перемещение. Особенностью модели является учет в ней возможности динамического изменения временного веса ребер графа при реализации перемещения колонны техники по выбранному маршруту. На основе использования данной модели предложен метод, которыйобеспечивает комплексный выбор состава колонны техники и оптимальных маршрутов ее движения по нестационарной сети дорог.Результаты. В статье предложен алгоритм, обеспечивающий решение оптимизационной задачи комплексного формирования состава колонны техники и выбора ее маршрута движения в условиях нефиксированного во времени веса ребер, которые описывают сеть дорог. Приведены особенности применения предложенного алгоритма. С использованием разработанного программного обеспечения исследовано вариант выбора техники из имеющегося неоднородного массива и выбора маршрута на графе с нестационарным временным весом ребер. На примере показано несовершенство решений комплексного формирования состава колонны и выбора ее оптимального маршрута движения на нестационарной сети дорог, полученных с использованием классических методов.Выводы. Неучет влияния возможного изменения дорожной обстановки, что проявляется изменением во времени временного веса ребер графа, которое описывает сеть дорог, на состав колонны техники может привести к неоптимальностиполучаемых решений с использованием классических методов формирования состава колонны и поиска кратчайшего маршрута в графе. Для получения оптимального состава колонны и маршрута с учетом изменения во времени дорожной обстановки при движении колонны, можно использовать предлагаемый в данном исследовании метод. Полученные результаты расширяют возможности теории дискретной оптимизации и теории графов.Актуальність. Ефективне вирішення ряду прикладних задач, що стосуються перевезень, як правило, залежить від розв’язання двох задач: коректного формування складу колони техніки та вдалого вибору маршруту її руху. Кожна із задач є оптимізаційною, методи вирішення яких на даний час опрацьовані. Теоретичні дослідження кожної з окремих задач і їх практичні застосування вказують на їх взаємозалежність і взаємообумовленість, що ще не до кінця вивчено. Практичні застосування обумовлюють необхідність розвитку відповідного науково-методичного апарату.Мета. Метою роботи є розробка методу розв’язання комплексної оптимізаційної задачі формування складу колони техніки та вибору маршруту її руху по нестаціонарній мережі доріг.Метод. У роботі запропонована математична модель розв’язування оптимізаційної задачі комплексного формування складу колони техніки та вибору її маршруту руху. Для опису масиву, з якого здійснюється вибір транспортних засобів, використано неоднорідну множину. Для опису мережі доріг використаний граф. В якості критерію оптимальності комплексної задачі виступає мінімізація часу, який витрачається на переміщення. Особливістю моделі є врахування у ній можливості динамічної зміни часових ваг ребер графу при реалізації переміщення колони техніки по обраному маршруту. На основі використання даної моделі запропоновано метод, який забезпечує комплексний вибір складу колони техніки та оптимальних маршрутів її руху на нестаціонарній мережі доріг.Результати. У статті запропоновано алгоритм, що забезпечує розв’язування оптимізаційної задачі комплексного формування складу колони техніки та вибору її маршруту руху в умовах нефіксованої в часі ваги ребер, які описують мережу доріг. Наведено особливості застосування запропонованого алгоритму. З використанням розробленого програмного забезпечення досліджено варіант вибору техніки з наявного неоднорідного масиву та вибору маршруту на графі з нестаціонарною часовою вагою ребер. На прикладі показано недосконалість рішень щодо комплексного формування складу колони та вибору її оптимального маршруту руху на нестаціонарній мережі доріг, отриманих з використанням класичних методів.Висновки. Неврахування впливу можливої зміни дорожньої обстановки, що проявляється зміною в часі часових ваг ребер графа, який описує мережу доріг, на склад колони техніки може призвести до неоптимальності отримуваних рішень з використанням класичних методів формування складу колони та пошуку найкоротшого маршруту в графі. Для отримання оптимального складу колони та маршруту з урахуванням зміни в часі дорожньої обстановки при русі колони, можна використати запропонований у даному дослідженні метод. Отримані результати розширюють можливості теорії дискретної оптимізації і теорії графів

Expression of adaptor protein Ruk/CIN85 isoforms in cell lines of various tissue origins and human melanoma

Aim: Development of monoclonal and polyclonal antibodies against recombinant GST-fused proteins including correspondingly N- and C-terminal parts of Ruk/CIN85 adaptor protein. Analysis of Ruk/CIN85 expression patterns in cell lines of various tissue origins and human melanoma. Methods: Recombinant GST-fused fragments of Ruk/CIN85 were expressed in bacterial system and affinity purified. Monoclonal antibodies against SH3A domain of Ruk/CIN85 were produced using hybridoma technique. The specificity of generated antibodies was examined by ELISA. Polyclonal antibodies against C-terminal coiled-coil region of Ruk/CIN85 were affinity purified from serum of immunized rabbit. Expression patterns of Ruk/CIN85 isoforms and their subcellular localization in cell lines of various tissue origins and human melanoma samples were analyzed by immunoblotting, immunoprecipitation and immunofluorescence microcopy. Results: Ruk/CIN85 is ubiquitously expressed SH3-containing adaptor/scaffold protein which plays important roles in signalling processes. N-terminal half of Ruk/CIN85 molecule, including three SH3 domains, and its C-terminal coiled-coil region were used as antigens to produce monoclonal and polyclonal antibodies, respectively. Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies (mAbs) to SH3 fragment of Ruk/CIN85 were established. One of the mAbs was extensively characterized and designated as MISh-A1. It was shown that this mAb recognizes an epitope, which resides within first SH3A domain. Polyclonal anti-Ruks Abs affinity purified from serum of immunized rabbit specifically recognized main Ruk/CIN85 isoforms, both endogenous and recombinant, in lysates of HEK293 cells. Notably, produced Abs did not cross-react with CD2AP, the member of the same family of adaptor/scaffold proteins. Multiple molecular forms of Ruk/CIN85 with apparent molecular weights of 130, 80–85, 70–75, 50–56, 34–40 and 29 kD were detected in cell lyzates of NIH3T3, Cos1, L1210, HEK293, Ramos, HeLa S3, MDCK, C6, A549 and U937 using anti-Ruk antibodies. Oligomerization between p85 and p50–56 forms of Ruk/CIN85 was revealed in C6 and NIH3T3 cells, but not in HeLa S3 and HEK293 cells by immunoprecipitation using MISh-A1 antibody following anti-Ruk Western-blot analysis. Using immunofluorescent microscopy and anti-Ruk antibodies, endogenous Ruk-variates were found mostly in cytoplasm of C6, NIH3T3, HEK293 cells and at lower level — in nuclei. Conclusion: Patterns of Ruk/CIN85 molecular forms expression are cell-specific and determined by cellular context. Assembly of oligomeric complexes between p85 and p50–56 Ruk/CIN85 isoforms in C6 and NIH3T3 cells but not in HeLa S3 and HEK293 cells may reflect their specific biological roles in different cell lines. High level of full-length Rukl/CIN85 form expression was revealed in extracts of human melanoma samples. Abs described in this paper may prove useful in future studies of Ruk/CIN85 expression and function in normal and transformed cells

Comparative study of expression of adaptor proteins Ruk/CIN85 and CD2AP/CMS in normal andtumor human uterus tissues

Adaptor proteins play an important role in facilitating protein-protein interactions and subsequent formation of signalling networks. These proteins recruit binding partners to a specific location inside the cell, and also regulate their activity. Adaptor protein Ruk/CIN85 and its structural and functional homologue CD2AP/CMS are important components of different regulatory pathways involved in control of cell proliferation, adhesion, invasion and survival, and, thus, can play a role in uterine carcinogenesis. In this work, we set out a comparative study of expression of Ruk/CIN85 and CD2AP/CMS at the level of mRNA and protein in intact uterine tissues, as well as in benign and malignant uterine tumors of different histological types. In most cases, an increase of expression levels of Ruk/CIN85 full-length form mRNA and protein, as well as CD2AP/CMS protein, were observed in uterine tumors, comparing with surrounding normal uterine tissues. Characteristic feature of conditionally normal uterine tissues, as well as benign uterine lesions, was an elevated content of high-molecular mass Ruk/CIN85 forms of 140 and 130 kDa, while an increased expression level of low-molecular mass 40 and 30 kDa Ruk/CIN85 forms was observed in the malignant tissue samples. Our findings suggest that an abnormal expression patterns of adaptor proteins Ruk/CIN85 and CD2AP/CMS in uterine tumors, and, thus, the corresponding changes in the activity of downstream signalling pathways, might be involved in maintenance of the malignant phenotype

Increased levels of the HER1 adaptor protein Ruk(l)/CIN85 contribute to breast cancer malignancy

The adaptor protein regulator for ubiquitous kinase/c-Cbl-interacting protein of 85kDa (Ruk/CIN85) was found to modulate HER1/EGFR signaling and processes like cell adhesion and apoptosis. Although these features imply a role in carcinogenesis, it is so far unknown how and by which molecular mechanisms Ruk/CIN85 could affect a certain tumor phenotype. By analyzing samples from breast cancer patients, we found high levels of Rukl/CIN85 especially in lymph node metastases from patients with invasive breast adenocarcinomas, suggesting that Rukl/CIN85 contributes to malignancy. Expression of Rukl/CIN85 in weakly invasive breast adenocarcinoma cells deficient of Rukl/CIN85 indeed converted them into more malignant cells. In particular, Rukl/CIN85 reduced the growth rate, decreased cell adhesion, enhanced anchorage-independent growth, increased motility in both transwell migration and wound healing assays as well as affected the response to epidermal growth factor. Thereby, Rukl/CIN85 led to a more rapid and prolonged epidermal growth factor-dependent activation of Src, Akt and ERK1/2 and treatment with the Src inhibitor PP2 and the PI3K inhibitor LY294002 abolished the Rukl/CIN85-dependent changes in cell motility. Together, this study indicates that high levels of Rukl/CIN85 contribute to the conversion of breast adenocarcinoma cells into a more malignant phenotype via modulation of the Src/Akt pathway