Pichia pastoris: an eukariotic system for the expression of recombinant therapeutic molecules

L’ideazione di farmaci antitumorali che riconoscono recettori o antigeni della superficie cellulare, come le Immunotossine, rappresentano un approccio promettente per il trattamento di pazienti affetti da cancro. La capacità di indurre l’apoptosi dell’Immunotossina IL4PE40 deriva dal frammento di 40 kDa della tossina PE (Pseudomonas esotossina A) e la sua specificità dalla forma permutata dell’interleuchina-4. IL4PE40 prodotta da E. coli è estratta dai corpi d’inclusione e purificata nella sua forma attiva tramite cromatografia di affinità. Comunque, la translazione clinica di molecole terapeutiche prodotte da E. coli è spesso difficoltosa, a causa di contaminazioni da endotossine e di protocolli laboriosi per la purificazione dei corpi d’inclusione che rendono difficile la riproducibilità della procedura di isolamento. Per superare questi svantaggi, ho clonato il gene di IL4PE40 in un vettore d’espressione per il lievito Pastoris pastoris. In letteratura è riportato che P. pastoris è in grado di secernere grammi per litro di proteine eterologhe in un terreno povero di proteine, economico e chimicamente definito. La presenza di un peptide segnale all’N-terminale della proteina ricombinante permette la secrezione della proteina nativa nel terreno di coltura. Inoltre il basso livello di secrezione di proteine endogene nel terreno di coltura, facilita i passaggi di purificazione del prodotto finale. Nel mio lavoro la resa di IL4PE40 prodotta dal lievito è stata ottimizzata dal utilizzo del “codon usage” del lievito e dall’analisi di diverse condizioni di induzione. Dopo l’ottimizzazione P. pastoris è in grado di produrre 120 µg di Immunotossina da un litro di coltura; questo quantità è lontana dai risultati ottenuti in altri lavori con proteine non tossiche. Inoltre, benché dopo l’ottimizzazione la resa sia aumentata, le proteine ottenute da colture ottimizzate di P. pastoris mostrano un considerevole livello di degradazione. La translocazione della proteina tossica nel citosol durante la biosintesi potrebbe portare ad una dminuzione della produzione. Inoltre, sembra che nel terreno del lievito siano presenti proteasi in grado di degradare la molecola ricombinante. Saggi di degradazione con la PE nativa e dati della letteratura suggeriscono che diverse proteasi (serine e subtilisine) potrebbero cooperare nella degradazione di IL4PE40. Nella mia tesi sono inoltre descritti esperimenti pianificati per superare queste limitazioni.Rationally designed anticancer agents targeting cell-surface antigens or receptors, such as Immunotoxins, represent a promising approach for treating cancer patients. The Immunotoxin IL4PE40 derives its activity to induce apoptosis from the 40 kDa PE fragment (Pseudomonas exotoxin A) and its specificity from the permuted form of interleukin-4. IL4PE40 produced in E. coli was extracted from inclusion bodies and purified by affinity chromatography, in its active form. However, the clinical translation of therapeutic molecules produced in E. coli is often difficult, due to endotoxin contaminations and laborious protocols of inclusion bodies purification that make hard the reproducibility of the isolation procedures. To overcome these disadvantages, I cloned the IL4PE40 gene into a yeast expression vector for use in the Pichia pastoris yeast. In the literature it is reported that P. pastoris can secrete grams per liter of foreign proteins in a protein-poor medium that is inexpensive and chemically defined. The presence of a signal peptide at the N-terminus of the recombinant protein allows the secretion of native protein within the culture medium. In addition, the low level of endogenous proteins secreted in the culture medium facilitates the purification steps of the final product. In my work the yield of IL4PE40 produced by yeast was optimized by yeast codon usage and by testing different induction conditions. After optimization the yeast P. pastoris was able to produce 120 µg of full-length Immunotoxin from 1 liter of culture, which is far from results obtained with non-toxic proteins by other workers. Moreover, although after optimization the yield increased, proteins obtained from optimized cultures of P. pastoris show a considerable level of degradation. The translocation of toxic fusion proteins in the cytosol during biosynthesis may lead to such low protein production. Additionally, it appears that proteases cleaving the recombinant molecules cold be present in the yeast medium. Preliminary cleavage assays with native PE and literature data suggest that several proteases (serine proteases and subtilisins) could cooperate in the IL4PE40 cleavage. Planned experiments to overcome these limitations are also described in my thesis

Monocentric Analysis of the Effectiveness and Financial Consequences of the Use of Lenograstim Versus Filgrastim for Mobilization of Peripheral Blood Progenitor Cells in Patients With Lymphoma and Myeloma Receiving Chemotherapy and Autologous Stem Cell Transplantation

Purpose: Granulocyte-colony stimulating factors (G-CSFs) are widely used to mobilize CD34+ stem cells and to support the engraftment after hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). A budget impact analysis and an incremental cost-effectiveness study of two G-CSFs (Lenograstim and Filgrastim biosimilar), considering engraftment, number of hospitalization days and number of G-CSF vials administered were performed. Patients and methods: Between 2009 and 2016, 248 patients undergoing autologous HSCT have been evaluated and divided into three groups (100 Leno-Leno, 93 Leno-Fil, 55 Fil-Fil) according to the type of G-CSF used for hematopoietic stem cell mobilization and hematopoietic stem cell recovery after transplant. Results: The following statistically significant differences have been observed between Leno-Leno, Leno-Fil, Fil-Fil groups: a higher number of harvested CD34+ cells (10.56 vs 8.00 vs 7.20; p=0.0003) and a lower number of G-CSF vials (8 vs 8 vs 9; p=0.00020) used for full bone marrow recovery favoring Lenograstim. No statistically significant differences were found regarding the number of G-CSF vials used for mobilization, apheresis number and CD34+ cell peak. The post-transplant hematological recovery was faster in Lenograstim group than Filgrastim group: median time to neutrophil count engraftment (>500/mmc) was 12 vs 13 days; median time for platelets recovery (>20.000/mmc) was 12 vs 15 days (p=0.0001). The use of Lenograstim achieved cost savings of \u20ac566/patient over Filgrastim biosimilar, related to a decreased number of days of hospitalization (16 vs 17 days; p=0.00012), a lower overall incidence of adverse events, laboratory tests, transfusions for platelet recovery following discharge. Conclusion: In our experience, Lenograstim outperforms Filgrastim in terms of effectiveness and lower cost. This study shows a clinical superiority of Lenograstim over Filgrastim suggesting a potential cost savings favoring Lenograstim

Il contributo dei dati sismici per la valutazione delle risorse idriche e geotermiche della pianura friulana

2006/2007L’attività di ricerca svolta in questi tre anni di dottorato ha coperto vari campi d’interesse nell’ambito della geologia e della geofisica con l’acquisizione, elaborazione ed interpretazione di dati sismici a riflessione ad alta risoluzione e l’applicazione alle ricostruzioni stratigrafiche per studi idrogeologici. I dati preesistenti da cui si è partiti sono state la “Mappa del Tetto dei Carbonati” e la “Mappa delle Isobate del Quaternario”, presentate all’interno del quaderno “Carta del Sottosuolo della Pianura Friulana” e realizzate dal DICA nel 2004 (Nicolich et al., 2004). Esso contiene anche cinque sezioni geologiche, derivate dall’interpretazione e conversione in profondità di linee sismiche, che attraversano la Pianura Friulana e Veneta orientale, e le stratigrafie dei pozzi per ricerche di idrocarburi presenti nel territorio. Queste mappe sono state riviste e corrette attraverso una serie di nuovo dati acquisiti nel corso di questi tre anni. Il primo passo è stato l’acquisizione di 8 km di linee sismiche a riflessione ad alta risoluzione, distribuite nei territori dei comuni di Aquileia (una linea lunga 4 km) e Grado (tre linee, per un totale di 4 km). Le linee sismiche hanno permesso di vedere in dettaglio la struttura del sottosuolo nell’area in studio. Le linee acquisite a Grado, inoltre, sono servite per posizionare il pozzo Grado-1. Con gli stessi criteri usati per l’interpretazione di queste linee sismiche è stata rivista la linea sismica ad alta risoluzione realizzata precedentemente dal DICA nel settore occidentale, nel territorio del comune di Precenicco. Successivamente sono state interpretate le linee sismiche a riflessione ad alta e altissima risoluzione, acquisite dall’OGS nel Golfo di Trieste e nelle Lagune di Marano e Grado. Tutti questi dati, una volta convertiti in profondità, hanno fornito le informazioni necessarie per l’estensione in mare delle due mappe prima citate. Lo scopo di questo lavoro è stato la definizione delle risorse geotermiche nel sottosuolo della Bassa Pianura Friulana. Per raggiungere questo obiettivo sono stati raccolti ed analizzati i dati da pozzo per ricerche idriche più affidabili presenti nella Bassa Pianura Friulana. In particolare sono state correlate le stratigrafie di 142 pozzi e, mediante l’utilizzo di un opportuno software commerciale (Rockworks), sono state identificati e definiti i sistemi di acquiferi di interesse geotermico esistenti nel sottosuolo, anche grazie all’ausilio di analisi geochimiche ed isotopiche effettuate dal gruppo di lavoro in pozzi scelti per un monitoraggio su lunghi tempi. La sequenza degli acquiferi è stata anche riportata sulle linee sismiche ad alta risoluzione acquisite a terra con il riconoscimento degli orizzonti riflettivi corrispondenti. Il risultato è stato illustrato con sezioni stratigrafiche 2D e successivi modelli interpretativi che mostrano estensione e spessori degli acquiferi, mappati in profondità con i corrispondenti valori di temperatura delle acque. Un lavoro analogo a quello svolto per i profili a terra e a mare nella Bassa Pianura e nel Golfo di Trieste, ovvero interpretazione e conversione in profondità dei dati, è stato eseguito per altre linee sismiche, acquisite preminentemente nell’Alta Pianura Friulana alla fine degli anni ’70 dall’Agip, concesse dalla stessa per tempi di riflessione fino a 1,5 s TWT, e ri-processate dall’OGS, su incarico della RAFVG, per recuperare dati più prossimi alla superficie con obiettivo applicazioni idrogeologiche. Le linee, interpretate sulla base delle conoscenze geologiche attuali e convertite in profondità, oltre a fornire le informazioni necessarie per il controllo e una migliore definizione delle Isobate del Tetto dei Carbonati e delle Isopache del Quaternario, mettono in evidenza le strutture geologiche del sottosuolo della pianura friulana, identificando la catena dinarica sepolta e le deformazioni sud-alpine. Le immagini chiariscono anche l’evoluzione delle strutturazioni tettoniche e delle sequenze deposizionali, con delimitazione dei riempimenti con i Flysch dinarici, con le sequenze mioceniche legate all’avanzamento delle unità sud-alpine, a partire dalla formazione indicata come Gruppo della Cavanella. Più in superficie è stata esaminata l’evoluzione delle sequenze plio-quaternarie con una migliore precisazione delle formazioni che costituiscono la base dei depositi dql Quaternario: substrato occupato dai carbonati mesozoici, dal Flysch eocenico, dalle molasse del Miocene e infine l’estensione del bacino di deposizione delle sequenze plioceniche.XX Ciclo197

Assessment of haematopoietic progenitor cell counting with the Sysmex\uae XN-1000 to guide timing of apheresis of peripheral blood stem cells.

BACKGROUND: Successful peripheral blood stem cell (PBSC) collection depends on optimal timing of apheresis, as usually determined by flow cytometry CD34-positive (+) cell count in peripheral blood (PB). Since this method is costly and labour-intensive, we evaluated the use of the Hematopoietic Progenitor Cell count programme on a Sysmex\uae XN haematologic analyser (XN-HPC) as a rapid and inexpensive alternative for predicting CD34+ cell count in PB samples. MATERIALS AND METHODS: Haematopoietic progenitor cell and CD34+ cell counts were compared using 273 PB samples collected from 78 healthy donors and 72 patients who underwent PBSC transplantation. We assessed the effectiveness of the XN-HPC in safely predicting pre-harvest CD34+ counts. The most efficient cut-off values of XN-HPC were identified. We also evaluated the imprecision (coefficient of variation, CV) and functional sensitivity. RESULTS: Imprecision of the XN-HPC count was <6.3% on daily measurement of three levels of quality control material. Functional sensitivity was 8.9 7106/L. A cut-off value of 6562 7106/L XN-HPC for multiple myeloma (MM) patients and 6530 7106/L for all other subjects had both 100% specificity and 100% positive predictive value for identifying samples with CD34+ cells 6520 7106/L. An XN-HPC threshold of <13 7106/L identified pre-harvest CD34+ cell count <10 7106/L with 100% sensitivity and 100% negative predictive value. DISCUSSION: The XN-HPC is a fast, easy and inexpensive test that can safely improve apheresis workflow thus possibly replacing other more expensive CD34 counts currently performed and promoting optimal timing of PBSC collection

Correlations of Seismic Velocities and Elastic Moduli with Temperature in Superhot and Enhanced Geothermal Systems

This paper presents correlations derived by linear regression analysis of seismic velocities VP and VS and elastic moduli EP and ES with temperature in Los Humeros superhot (SHGS) and Acoculco enhanced (EGS) geothermal systems at depths down to 3 km below the surface and temperatures up to approximately 400 °C. In Los Humeros, the seismic velocity models were derived from the inversion of legacy active seismic survey data acquired in 1998, as well as from passive seismic monitoring and ambient seismic noise interferometry carried out during 2017–2019 by the GEMex consortium. In the Acoculco EGS, ambient seismic noise data were used. Steady-state formation temperatures were re-evaluated during and after the end of the GEMex project using measurements provided as a courtesy of the Federal Electricity Commission of Mexico (CFE). The density data needed for the calculation of elastic moduli were provided by the GEMex consortium, as derived from the inversion of regional and local gravity surveys. The analysis indicated that statistically significant correlations of seismic parameters to temperature exist in the vertical direction, namely exponential in Los Humeros superhot and logarithmic in Acoculco EGS, but no correlation was evident in the horizontal direction. This result suggests an indirect relationship among the considered variables due to interdependence on other parameters, such as pressure and vapor saturation. As the analysis was performed using only data obtained from sensing-at-surface methods, without direct geophysical calibration at depth, a distributed fiber-optic seismic and temperature sensing system at both surface and downhole is proposed for active-source and passive seismic monitoring, and seismic-while-drilling by the drill-bit source is considered for reverse vertical seismic profile (RVSP) recording whenever possible for future high-temperature geothermal applications

Correlations of Seismic Velocities and Elastic Moduli with Temperature in Superhot and Enhanced Geothermal Systems

This paper presents correlations derived by linear regression analysis of seismic velocities VP and VS and elastic moduli EP and ES with temperature in Los Humeros superhot (SHGS) and Acoculco enhanced (EGS) geothermal systems at depths down to 3 km below the surface and temperatures up to approximately 400 °C. In Los Humeros, the seismic velocity models were derived from the inversion of legacy active seismic survey data acquired in 1998, as well as from passive seismic monitoring and ambient seismic noise interferometry carried out during 2017–2019 by the GEMex consortium. In the Acoculco EGS, ambient seismic noise data were used. Steady-state formation temperatures were re-evaluated during and after the end of the GEMex project using measurements provided as a courtesy of the Federal Electricity Commission of Mexico (CFE). The density data needed for the calculation of elastic moduli were provided by the GEMex consortium, as derived from the inversion of regional and local gravity surveys. The analysis indicated that statistically significant correlations of seismic parameters to temperature exist in the vertical direction, namely exponential in Los Humeros superhot and logarithmic in Acoculco EGS, but no correlation was evident in the horizontal direction. This result suggests an indirect relationship among the considered variables due to interdependence on other parameters, such as pressure and vapor saturation. As the analysis was performed using only data obtained from sensing-at-surface methods, without direct geophysical calibration at depth, a distributed fiber-optic seismic and temperature sensing system at both surface and downhole is proposed for active-source and passive seismic monitoring, and seismic-while-drilling by the drill-bit source is considered for reverse vertical seismic profile (RVSP) recording whenever possible for future high-temperature geothermal applications

Progetto Geotermia-Grado per il riscaldamento di edifici pubblici: il pozzo esplorativo e il potenziale geotermico

Il Progetto Geotermia-Grado costituisce la prima iniziativa sul territorio della Regione Friuli Venezia Giulia, per la valutazione e lo sfruttamento razionale delle acque geotermiche contenute nei calcari sepolti a circa 600-700 m di profondit\ue0, mediante un impianto pilota di teleriscaldamento a due pozzi (uno di estrazione ed uno di re-iniezione), che dovr\ue0 essere adibito al riscaldamento di edifici pubblici nella citt\ue0 di Grado (GO). Il progetto rientra negli obiettivi previsti dal Documento Unico di Programmazione, Obiettivo 2, 2000 \u2013 2006 della Regione Autonoma Friuli Venezia Giulia, ed \ue8 finanziato nell\u2019ambito dell\u2019Azione 3.1.2. \u201cValorizzazione delle fonti energetiche rinnovabili\u201d, con finanziamenti della Comunit\ue0 Europea. Le ricadute applicativa di questo progetto sono rilevanti in quanto hanno permesso di valutare la risorsa geotermica a bassa entalpia dell\u2019area di Grado e laguna circostante e permetteranno di completare il progetto e di replicare impianti analoghi in altre aree favorevoli della zona costiera veneto-friulana. La prima fase esplorativa del progetto per la caratterizzazione e la quantificazione della risorsa geotermica disponibile nel sottosuolo, avviata nel 2005 e a conclusione entro giugno 2008, ha permesso di portare a termine le indagini geologiche e geofisiche per il posizionamento del pozzo, la progettazione del pozzo stesso, l\u2019espletamento della gara di appalto, la perforazione del pozzo esplorativo Grado-1 fino a 1108 m di profondit\ue0 dal p.c. con esecuzione delle prove di portata e dei logs da pozzo. Questa fase \ue8 stata attuata dalla Regione Friuli Venezia Giulia (con la direzione tecnica e supervisione scientifica del DICA, Universit\ue0 di Trieste) ed una spesa complessiva di circa 1.4 M\u20ac. La seconda fase consister\ue0 nella perforazione del secondo pozzo e nella realizzazione degli impianti di superficie (scambiatori di calore, condotte isolate e allacciamenti) e sar\ue0 attuata dal Comune di Grado. La tipologia di questo impianto di sfruttamento \ue8 nota come \u201cdoppietto geotermico\u201d ed \ue8 ampiamente utilizzata in diversi Paesi del mondo

Reductive activation of type 2 ribosome inactivating proteins (RIPs 2) is promoted by transmembrane thioredoxin-related protein (TMX)

Members of the type 2 ribosome-inactivating proteins (RIPs) family (e.g. ricin, abrin) are potent cytotoxins showing a strong lethal activity towards eukaryotic cells. Type 2 RIPs contain two polypeptide chains (usually named A, for activity, and B, for binding) linked by a disulfide bond. The intoxication of the cell is a consequence of a reductive process in which the toxic domain is cleaved from the binding domain by oxidoreductases located in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). The best known example of type 2 RIPs is ricin. Protein disulfide isomerase (PDI) was demonstrated to be involved in the process of ricin reduction, however when PDI is depleted from cell fraction preparations ricin reduction can still take place indicating that also other oxidoreductases might be implicated in this process. We have investigated the role of TMX, a transmembrane thioredoxin-related protein member of the PDI-family, in the cell intoxication operated by type 2 RIPs ricin and abrin. Over-expressing TMX in A549 cells resulted in a dramatic increase of ricin or abrin cytotoxicity as compared with control mock-treated cells. Conversely, no difference in cytotoxicity was observed after treatment of A549 cells or control cells with saporin or pseudomonas exotoxin A whose intracellular mechanism of activation is not dependent upon reduction (saporin) or only partially dependent upon it (pseudomonas exotoxin A). Moreover the silencing of TMX in the prostatic cell line DU145 reduced the sensitivity of the cells to ricin intoxication further confirming a role for this enzyme in intracellular ricin activation

Geophysical and Geological Views of Potential Water Resources in the North-Eastern Adriatic Sea

The increasing demand for freshwater requires the identification of additional and less-conventional water resources. Amongst these, offshore freshwater systems have been investigated in different parts of the world to provide new opportunities to face increasing water requests. Here we focus on the north-eastern Adriatic Sea, where offshore aquifers could be present as a continuation of onshore ones. Geophysical data, in particular offshore seismic data, and onshore and offshore well data, are interpreted and integrated to characterise the hydrogeological setting via the interpretation of seismo-stratigraphic sequences. We focus our attention on two areas located in the proximity of the Tagliamento and Isonzo deltas. Well and seismic data indicate that the Quaternary sediments, that extend from onshore to offshore areas, are the most promising from an offshore freshwater resources point of view, while the several kilometres thick pre-Quaternary carbonate and terrigenous sequences likely host mainly salty waters