Probing the relationship between Gram-negative and Gram-positive S1 proteins by sequence analysis

Escherichia coli ribosomal protein S1 is required for the translation initiation of messenger RNAs, in particular when their Shine–Dalgarno sequence is degenerated. Closely related forms of the protein, composed of the same number of domains (six), are found in all Gram-negative bacteria. More distant proteins, generally formed of fewer domains, have been identified, by sequence similarities, in Gram-positive bacteria and are also termed ‘S1 proteins’. However in the absence of functional information, it is generally difficult to ascertain their relationship with Gram-negative S1. In this article, we report the solution structure of the fourth and sixth domains of the E. coli protein S1 and show that it is possible to characterize their β-barrel by a consensus sequence that allows a precise identification of all domains in Gram-negative and Gram-positive S1 proteins. In addition, we show that it is possible to discriminate between five domain types corresponding to the domains 1, 2, 3, 4–5 and 6 of E. coli S1 on the basis of their sequence. This enabled us to identify the nature of the domains present in Gram-positive proteins and, subsequently, to probe the filiations between all forms of S1

Activation of RegB endoribonuclease by S1 ribosomal protein requires an 11 nt conserved sequence

The T4 RegB endoribonuclease cleaves specifically in the middle of the -GGAG- sequence, leading to inactivation and degradation of early phage mRNAs. In vitro, RegB activity is very weak but can be enhanced 10- to 100-fold by the Escherichia coli ribosomal protein S1. Not all RNAs carrying the GGAG motif are cleaved by RegB, suggesting that additional information is required to obtain a complete RegB target site. In this work, we find that in the presence of S1, the RegB target site is an 11 nt long single-stranded RNA carrying the 100% conserved GGA triplet at the 5′ end and a degenerate, A-rich, consensus sequence immediately downstream. Our data support the notion that RegB alone recognizes only the trinucleotide GGA, which it cleaves very inefficiently, and that stimulation of RegB activity by S1 depends on the nucleotide immediately 3′ to -GGA-

Structure and Functional Analysis of the RNA- and Viral Phosphoprotein-Binding Domain of Respiratory Syncytial Virus M2-1 Protein

Respiratory syncytial virus (RSV) protein M2-1 functions as an essential transcriptional cofactor of the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complex by increasing polymerase processivity. M2-1 is a modular RNA binding protein that also interacts with the viral phosphoprotein P, another component of the RdRp complex. These binding properties are related to the core region of M2-1 encompassing residues S58 to K177. Here we report the NMR structure of the RSV M2-158–177 core domain, which is structurally homologous to the C-terminal domain of Ebola virus VP30, a transcription co-factor sharing functional similarity with M2-1. The partial overlap of RNA and P interaction surfaces on M2-158–177, as determined by NMR, rationalizes the previously observed competitive behavior of RNA versus P. Using site-directed mutagenesis, we identified eight residues located on these surfaces that are critical for an efficient transcription activity of the RdRp complex. Single mutations of these residues disrupted specifically either P or RNA binding to M2-1 in vitro. M2-1 recruitment to cytoplasmic inclusion bodies, which are regarded as sites of viral RNA synthesis, was impaired by mutations affecting only binding to P, but not to RNA, suggesting that M2-1 is associated to the holonucleocapsid by interacting with P. These results reveal that RNA and P binding to M2-1 can be uncoupled and that both are critical for the transcriptional antitermination function of M2-1

The evolving SARS-CoV-2 epidemic in Africa: Insights from rapidly expanding genomic surveillance

INTRODUCTION Investment in Africa over the past year with regard to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) sequencing has led to a massive increase in the number of sequences, which, to date, exceeds 100,000 sequences generated to track the pandemic on the continent. These sequences have profoundly affected how public health officials in Africa have navigated the COVID-19 pandemic. RATIONALE We demonstrate how the first 100,000 SARS-CoV-2 sequences from Africa have helped monitor the epidemic on the continent, how genomic surveillance expanded over the course of the pandemic, and how we adapted our sequencing methods to deal with an evolving virus. Finally, we also examine how viral lineages have spread across the continent in a phylogeographic framework to gain insights into the underlying temporal and spatial transmission dynamics for several variants of concern (VOCs). RESULTS Our results indicate that the number of countries in Africa that can sequence the virus within their own borders is growing and that this is coupled with a shorter turnaround time from the time of sampling to sequence submission. Ongoing evolution necessitated the continual updating of primer sets, and, as a result, eight primer sets were designed in tandem with viral evolution and used to ensure effective sequencing of the virus. The pandemic unfolded through multiple waves of infection that were each driven by distinct genetic lineages, with B.1-like ancestral strains associated with the first pandemic wave of infections in 2020. Successive waves on the continent were fueled by different VOCs, with Alpha and Beta cocirculating in distinct spatial patterns during the second wave and Delta and Omicron affecting the whole continent during the third and fourth waves, respectively. Phylogeographic reconstruction points toward distinct differences in viral importation and exportation patterns associated with the Alpha, Beta, Delta, and Omicron variants and subvariants, when considering both Africa versus the rest of the world and viral dissemination within the continent. Our epidemiological and phylogenetic inferences therefore underscore the heterogeneous nature of the pandemic on the continent and highlight key insights and challenges, for instance, recognizing the limitations of low testing proportions. We also highlight the early warning capacity that genomic surveillance in Africa has had for the rest of the world with the detection of new lineages and variants, the most recent being the characterization of various Omicron subvariants. CONCLUSION Sustained investment for diagnostics and genomic surveillance in Africa is needed as the virus continues to evolve. This is important not only to help combat SARS-CoV-2 on the continent but also because it can be used as a platform to help address the many emerging and reemerging infectious disease threats in Africa. In particular, capacity building for local sequencing within countries or within the continent should be prioritized because this is generally associated with shorter turnaround times, providing the most benefit to local public health authorities tasked with pandemic response and mitigation and allowing for the fastest reaction to localized outbreaks. These investments are crucial for pandemic preparedness and response and will serve the health of the continent well into the 21st century

Détermination de la structure en solution de deux domaines de la protéine ribosomique S1 et étude phylogénétique des domaines S1 (Mise en évidence d'un complexe ternaire RegB/S1/ARN dans la coupure des ARN par RegB)

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Caractérisation des méthodes de liaison de la protéine ribosomique S à la sous-unité 30S du ribosome d'Escherichia coli par Résonance Magnétique Nucléaire

La protéine S1, la plus grande des protéines du ribosome d Escherichia coli, est une protéine modulaire composée de six répétitions d un domaine conservé. Son rôle essentiel dans la cellule, notamment pendant le démarrage de la traduction, est de permettre la reconnaissance, par le ribosome, du site d initiation de la traduction des ARNm dont la séquence Shine-Dalgarno est dégénérée ou absente. S1 est également présente dans d autres complexes, notamment dans la réplicase du phage Q . Il a été montré que la région d interaction de la protéine S1 avec la polymérase de la réplicase était portée par les deux premiers domaines de la protéine, tout comme pour l interaction avec la sous-unité 30S. Cependant, si les fonctions de S1 sont bien connues, son mécanisme d action demeure incertain. Notre objectif est donc d étudier, par Résonance Magnétique Nucléaire à très haut champ, les bases moléculaires de l interaction de la protéine S1 avec la sous-unité 30S. J ai attribué les fréquences de résonance du squelette peptidique des domaines impliqués dans la liaison de S1 sur la sous-unité 30S, d abord sur un fragment composé de ces deux domaines, puis sur la protéine S1 entière. J ai également transposé les attributions des quatre derniers domaines de S1, obtenus à partir de fragments isolés, sur la protéine entière. Cela m a permis de mettre en évidence des comportements différents pour les deux domaines responsables de l interaction. Combinées aux informations obtenues au laboratoire sur l organisation des domaines de la protéine S1 liant l ARN messager, ces données permettent d établir des hypothèses sur l organisation de la protéine au sein de la sous-unité 30S du ribosomePARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Biochemical and biophysical characterization of proteins involved in human diseases (enzymatic activity of nucleotide binding domains of the multidrug-resistance protein MRP1 and structural information by solid state NMR of the prion protein)

Ce travail comporte deux projets indépendants. L'objet du premier était de produire et de caractériser les deux domaines de liaison aux nucléotides (NBD1 et NBD2) du transporteur ABC humain ABCC1/MRP1 d'un point de vue fonctionnel et/ou structural. Ceux-ci fournissent l'énergie nécessaire au transport de substrats à travers la membrane, en particulier pour l'export de molécules utilisées en chimiothérapie par des cellules cancéreuses. L'enjeu était de produire de grandes quantités du domaine NBD2 monom re pour des études structurales. Plusieurs approches ont été utilisées pour augmenter la solubilité de NBD2 sous forme de protéine recombinante dans E. coli : différents construits, co-expression de chaperons et expression en corps d'inclusion suivie de renaturation. Mais la qualité des échantillons n'a jamais été suffisante pour envisager de poursuivre, par RMN en particulier. NBD1, dont la structure était déjà disponible, a été produit et purifié. La protéine sauvage ainsi qu'un mutant ne liant plus les nucléotides ont été testés pour une activité adénylate kinase, mise en évidence pour d'autres transporteurs ABC. Nous avons montré que dans le cas de MRP1 cette activité n'était pas liée à NBD1.Une deuxième partie a été consacrée à l'étude de la forme amyloïde du domaine H2H3 de la protèine du prion PrP, responsable d'encéphalopathies spongiformes transmissibles. L'objectif principal était l'amélioration de la qualité des échantillons pour des études par RMN du solide par sélection des voies d'oligomérisation. Au cours de ces études, nous avons pu montrer que le domaine H2H3 était suffisant pour transférer l'information structurale au cours du processus de fibrillisationIn the present work we dealt with two independent projects. The aim of the first part was to produce and functionally and/or structurally characterize the two nucleotide-binding domains (NBD1 and NBD2) of the human ABC transporter ABCC1/MRP1, which are needed to power the transport of substrates across the cell membrane, e.g. the export of chemotherapeutics from cancer cells. While a crystal structure together with functional reports are available for isolated NBD1, it has so far not been possible to produce large quantities of monomeric NBD2 to enable a more extensive structural/enzymatic characterization. Here, we tested a series of new approaches to increase the solubility of NBD2 expressed as a recombinant protein in E. coli, including the use of different constructs, co-expression of chaperones, expression in inclusion bodies and refolding. Unfortunately this did not sufficiently improve the quality of NBD2 samples in terms of oligomeric state to envisage further investigation by NMR. In contrast, NBD1 could be produced and purified. The wildtype protein together with an a priori non ATP-binding mutant were tested for adenylate kinase activity, which had been reported for other ABC transporters, but which we showed not to be part of the activity spectrum of NBD1. In the second part we dealt with the H2H3 domain of the transmissible spongiform encephalopathy causing protein PrP in its amyloid conformation. The main objective was to improve sample quality for solid state NMR measurements by oligomerization pathway selection. Within the scope of this project we could show that the H2H3 domain is sufficient for structural information transference during fibrillationPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF

Détermination de la structure de protéines à l aide de données faiblement résolues

La connaissance des structures tridimensionnelles des macromolécules biologiques est indispensable pour mieux comprendre leur rôle et pour la conception de nouvelles molécules thérapeutiques. Les techniques utilisées actuellement offrent une grande variété d approches qui utilisent à la fois des informations spécifiques à la protéine étudiée et des informations génériques communes à l ensemble des protéines. Il est possible de classer ces méthodes en fonction de la quantité d information utilisée dans chacune de ces deux catégories avec d un côté des méthodes utilisant le plus possible de données spécifiques à la protéine étudiée et de l autre les méthodes utilisant le plus possibles de données génériques présentes dans les bases de données.Le travail présenté dans cette thèse aborde deux utilisations de techniques mixtes, présentant une autre combinaison entre données spécifiques et données génériques. En particulier nous avons cherché à obtenir la structure de protéines composée d un ou deux domaines en ne disposant que d un nombre restreint de données spécifiques. Pour déterminer la structure d une protéine de grande taille composée de deux domaines à l aide de données de diffusion des rayons X et de modèles obtenus par de la modélisation par homologie, nous avons adapté puis optimisé un programme récemment développé au laboratoire. Nous avons ensuite modélisé la structure d un domaine d une protéine de virus en incorporant un faible nombre de contraintes issues des données obtenues par RMN dans une méthode de prédiction de structure ab initio . Enfin, nous avons étudié l intérêt d intégrer les courants de cycle, une composante du déplacement chimique, dans un programme d arrimage moléculaire pour la résolution de complexes protéine-ADN.PARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Etude fonctionnelle et structurale, par RMN, de la région C-terminale de la protéine ribosomique S1 d'Escherichia coli (caractérisation d'un mécanisme unique de reconnaissance des ARNs)

La protéine SI est la plus grande des protéines du ribosome d' Escherichia coli. Cette protéine modulaire est composée de six répétitions d'un domaine conservé. SI joue un rôle essentiel dans le démarrage de la traduction en permettant l'initiation de la traduction des messagers procaryotes (gram négatif) dont la région Shine-Dalgamo (SD) est dégénérée ou absente. SI est aussi utilisée par plusieurs bactériophages. Entre autre, elle est capable d'accélérer l'activité de l'endoribonucléase RegB du bactériophage T4, dont la fonction est d'inactiver certains messagers du phage en les clivant au milieu de leur séquence SD. Il a été montré que les fonctions de SI, dans la traduction et dans l'activation de RegB, sont portées par la même région (fragment F345) et semblent correspondre au même mécanisme moléculaire. Cependant, son mode d'action reste inconnu. Notre objectif est donc d'étudier par RMN l'organisation de cette région de SI et d'analyser ses interactions avec différents ARN afin de proposer un mécanisme moléculaire. J'ai caractérisé par RMN les surfaces d'interactions entre les domaines 3, 4 et 5 au sein du fragment F345 ce qui m'a permis de proposer un modèle d'organisation de cette région. Les données trouvées dans la littérature associées aux résultats issus des études d'interactions de SI avec différents ARN ont permis de faire l'hypothèse que la fonction de SI ne serait pas simplement de reconnaître une région particulière de l'ARN. SI serait capable de se lier à n'importe quel ARN et d'induire une déformation favorisant l'interaction de la séquence avec un troisième partenaire (le ribosome dans le cadre de la traduction ou encore la ribonucléase RegB).SI protein is the largest ribosomal protein of Escherichia coli. This modular protein is .composed of six identical motifs. SI plays a key role in the translation initiation of prokaryote messengers when the Shine-Dalgamo sequence is degenerated or lacks. SI is used by several phages. This protein is able to accelerate the endoribonuclease RegB activity which function is to inactivate sorne of the phage messengers by cleaving them at the rniddle of their SD sequences. One SI region (F345) presents SI functions of translation and RegB activation, it corresponds to the same molecular mechanism but its role remains unknown. Our aim is to study, by NMR, the organisation of SI region and analyse the interactions with several RNA to suggest a molecular mechanism. 1 characterized, by NMR, interactions surfaces between domains 3, 4 and 5 in the F345 fragment, which allows us to suggest an organisation model of this region. Data found in the bibliography associated to the results of SI interaction studies with different RNA show that SI is able to bind any RNA and to induce a deformation that promotes the interaction with a third partner (Ribosome in the case of translation or RegB ribonuclease).ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF