Study on Real-Time PCR-Based Approaches for Multiple Targets Detection

作为重要的均相检测技术，实时PCR因具有快速、简便、灵敏、特异、可定量等优点，已被广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。然而，受目前实时PCR仪可检测的荧光通道数目的限制，实时PCR存在检测容量小的问题，难以在单次反应中检测多个靶序列。针对这个问题，本论文对实时PCR多靶检测技术展开了研究，研究工作主要包括对多色组合探针编码技术的研究及探针熔解曲线分析技术的研究。 第一部分，提出了多色组合探针编码技术，并考察了该技术分别用于多靶识别和多突变检测的可行性。在该部分第一章，以多种食源性致病菌为检测对象，利用改良分子信标作为检测探针，将多色组合探针编码技术用于八种食源性致病菌的识别，所建立的检...Real-time PCR has become a powerful tool for quantitative and qualitative nucleic acids analysis, and has been broadly applied in the scientific, medical, and diagnostic communities. However, the number of targets that can be detected in a single real-time PCR is limited to four or five due to the limited number of channels in a real-time PCR apparatus. To address this issue, this dissertation foc...学位：理学博士院系专业：生命科学学院生物医学科学系_生物化学与分子生物学学号：2162006015332

基于多色探针熔解曲线分析技术的华法林个体化用药相关基因多态性快速检测方法

华法林是一种广泛使用的抗凝剂，其治疗窗口较窄，患者间达到抗凝所需剂量的变异性大。已有研究表明CYP2C9*3 (rs1057910)、CYP2C9 IVS3-65G>C (rs9332127)、VKORC1 c.-1639G>A (rs9923231)和CYP4F2*3 (rs2108622)的单核苷酸多态性（SNP）是影响中国人群华法林敏感性的主要遗传因素。该研究利用多色探针熔解曲线（MMCA）技术，建立可同时检测4个华法林敏感性基因多态性的单管PCR反应体系，可在2.5 h内完成检测，能检测低至50 pg/反应的人基因组DNA。对218份厦门地区随机人群各SNP进行筛查结果及部分样本测序结果表明，MMCA体系有极高的准确性，厦门地区各SNP的发生频率与此前报道的中国汉族人群相近，其中rs1057910的等位基因A和C的频率分别为96.3%和3.7%；rs9332127的等位基因G和C的频率分别为96.3%和3.7%；rs9923231的等位基因G和A的频率分别为92.2%和7.8%；rs2108622等位基因G和A的频率分别为75.7%和24.3%。基于MMCA技术的SNP分型体系具有快速、简便、准确、低成本等优点，适合在临床实验室推广使用。厦门市科技计划项目（3502Z20179044）;;\n福建省高校杰出青年科研人才培育计划项

基于多色探针熔解曲线分析技术的华法林个体化用药相关基因多态性快速检测方法

华法林是一种广泛使用的抗凝剂,其治疗窗口较窄,患者达到抗凝所需剂量的变异性大.已有研究表明CYP2C9*3 (rs1057910)、CYP2C9IVS3-65G>C(rs9332127)、VKORC1 c.-1639G>A (rs9923231)和CYP4F2*3 (rs2108622)的单核苷酸多态性(SNPs)是影响中国人群华法林敏感性的主要遗传因素.该研究利用多色探针熔解曲线分析(MMCA)技术,建立可同时检测4个华法林敏感性基因多态性位点的单管PCR反应体系,可在2.5h内完成检测,每个反应能检测低至0.05ng的人基因组DNA.对218份厦门市随机人群的4类SNPs进行筛查及其中40份样本测序的结果表明,MMCA体系准确性高,厦门市人群的4类SNPs发生频率与此前报道的中国汉族人群的相近,其中rs1057910的等位基因A和C的频率分别为96.4%和3.6%,rs9332127的等位基因G和C的频率分别为96.4%和3.6%,rs9923231的等位基因G和A的频率分别为7.8%和92.2%,rs2108622的等位基因G和A的频率分别为75.7%和24.3%.上述基于MMCA技术的SNP分型体系具有快速、简便、准确、低成本等优点,适合在临床上推广用于指导华法林用药剂量.福建省高校杰出青年科研人才培育计划项目厦门市科技计划项目（3502Z20179044

多色探针熔解曲线法在卡马西平不良反应相关基因检测中的临床评价

目的对多色探针熔解曲线法(multicolor melting curve analysis,MMCA)用于卡马西平不良反应相关的HLA-B*15:02基因检测进行临床评价。方法收集厦门市中心血站1 147份厦门地区无偿献血者的外周静脉血样本,经基因DNA提取后,按双盲对照试验,分别应用MMCA法和HLA-SBT测序法对各样本进行HLA-B*15:02基因检测,比较2种检测方法的符合率。对于检测结果不一致的标本,采用第三方Sanger测序和电泳验证,计算总符合率。结果采用MMCA法共检出77份HLA-B*15:02阳性标本,1 070份HLA-B*15:02阴性标本。采用HLA-SBT测序法共检出74份HLA-B*15:02阳性标本,1 070份HLA-B*15:02阴性标本,以及3份无明确的分型信息的标本(仅显示为B*15:VG-B*15:CYS型)。该3份标本经Sanger测序以及电泳验证,确认为HLA-B*15:02阳性标本。因此,MMCA法检测HLA-B*15:02基因的阳性检出率为100%(77/77),阴性检出率为100%(1 070/1 070),总符合率为100%(1 147/1 147)。此外,在1 147份临床标本中共检出77份阳性结果,HLA-B*15:02的携带率为6.7%(77/1147),这与文献报道的数据基本一致。结论 MMCA法用于HLA-B*15:02基因的检测,具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点,可应用于卡马西平不良反应相关的HLA-B*15:02基因的临床辅助检测

闽南地区湿热内蕴证辨治初探

气候、饮食、吸烟是导致闽南地区湿热内蕴的常见病因。要根据湿热的性质和部位,结合药物的性味、归经处方用药,调整气机升降出入。并以肿瘤湿热内蕴验案为例,提出辨治要点。第六批全国老中医药专家学术经验继承工作项目(No.国中医药人教发[2017]29号

锁核酸修饰探针熔解曲线分析在Kras基因突变检测中的应用

以探针熔解曲线技术为平台，结合锁核酸（LNA）修饰探针建立熔解曲线分析（MCA）体系（MCA-LNA体系），实现一管同时检测Kras基因中7个热点突变，并通过对探针的改良达到富集突变型的效果，使其分析灵敏度得到明显提升，达0.05%～0.5%。利用MCA-LNA体系对72份临床结直肠癌标本进行KRAS突变检测，共检出24份阳性标本，与普通探针熔解曲线技术相比多检出5份突变阳性标本，经扩增阻碍突变系统（ARMS）方法验证为突变型。由上述结果可见MCA-LNA体系能显著提高检测限和阳性标本检出率，更有利于基因筛查和指导靶向治疗。福建省高校杰出青年科研人才培育计

Natural phage nanoparticle-mediated real-time immuno-PCR for ultrasensitive detection of protein marker

Key Laboratory Funding Scheme of Guangdong Provincial Government [2011A060901013]; National Scientific Foundation of China (NSFC) [31100723]Current immuno-PCR methods either use bare or nanostructured DNA as a reporter or combine phage display for antigen binding and reporting, however, they are often complex to carry out and lack universality. We present a novel and universal design of immuno-PCR termed natural phage nanoparticle-mediated real-time immuno-PCR

软配位原子效应在锌和镉分离中的应用

研究了锌和镉在二（1，1，3，3-四甲基丁基）膦酸（HMBP）及二（1，1，3，3-四甲基丁基）巯基膦酸（HMTP）／环己烷-硝酸体系中的萃取行为。以软配位原子-硫取代HMBP分子中的羟基氧原子而得到的HMTP对镉具有良好的选择性。以HMTP为萃取剂，仅一次萃取可以实现锌和镉的定量分离

锁核酸修饰探针熔解曲线分析在Kras基因突变检测中的应用

以探针熔解曲线技术为平台,结合锁核酸(LNA)修饰探针建立熔解曲线分析(MCA)体系(MCA-LNA体系),实现一管同时检测Kras基因中7个热点突变;并通过对探针的改良达到富集突变型的效果,使其分析灵敏度得到明显提升,达0.05%～0.5%.利用MCA-LNA体系对72份临床结直肠癌标本进行Kras突变检测,共检出24份阳性标本,与普通探针MCA体系相比多检出5份突变阳性标本,经扩增阻碍突变系统(ARMS)验证为突变型.由上述结果可见MCA-LNA体系能提高检测限和阳性标本检出率,更有利于精准基因筛查和指导靶向治疗.福建省高校杰出青年科研人才培育计

Epidemiological survey of non-deletional α-thalassemia in population of Xiamen area

目的调查厦门地区非缺失型α-地中海贫血的发生率,探讨在厦门地区开展非缺失型α-地中海贫血检测的必要性和意义。方法收集2013年1至6月厦门市妇幼保健院的α-地中海贫血高危人群的外周血及脐带血标本450份,经核酸基因组提取后,利用的荧光PCr熔解曲线法对这450份样本进行三种常见非缺失型α-地中海贫血基因(αCSα/、αQSα/、αWSα/)检测,再综合常见三种缺失型α-地中海贫血基因(--SEA/、-α3.7/、-α4.2/)检测结果,判定标本的α-地中海贫血基因型,统计非缺失型α-地中海贫血发生率。结果 450例标本共检出15例非缺失型α-地中海贫血携带者,非缺失型α-地中海贫血基因发生率为3.33%(15/450),其中αCSα/、αQSα/、αWSα/的发生率依次为1.56%(7/450)、1.11%(5/450)、0.67%(3/450)。结论非缺失型α-地中海贫血在厦门地区具有较高的发生率,厦门地区应将常见非缺失型α-地中海贫血基因(αCSα/、αQSα/、αWSα/)检测作为地中海贫血基因诊断和产前诊断的对象,从而提高地中海贫血的检出率。Objective:To investigate the incidence of non-deletional α-thalassemia in Xiamen area,and explore the importance and significance of non-deletional α-thalassemia detection.Methods:From January 2013 to June 2013,peripheral blood or and umbilical cord blood of 450 cases with high risk of α-thalassemia were collected from the Maternal and Child Health Care Hospital of Xiamen.After genomic DNA extraction,all samples were detected for the three common non-deletional α-thalassemia mutations(αCSα/,αQSα/,αWSα/)in Chinese population by multicolor fluorescence melting curve analysis method.The genotype of each case with non-deletional α-thalassemia mutation was determined according to the three common deletional α-thalassemia mutations(--SEA/,-α3.7/,-α4.2/),and then the incidence of non-deletional α-thalassemia mutation was calculated.Results:Totally 15 non-deletional α-thalassemia mutation carriers were detected among 450 samples,which meant the incidence of non-deletional α-thalassemia was 3.33%(15/450),including αCSα/ 1.56%(7/450),αQSα/ 1.11%(5/450)and αWSα/ 0.67%(3/450).Conclusion:Xiamen is the area with high risk of non-deletional α-thalassemia,and it should be important and useful to detect non-deletional α-thalassemia mutations in the area for prevention of thalassemia disease.国家自然科学基金科学青年基金项目(编号:81101323); 厦门大学大学生创新创业训练计划项目(编号:DC2013149