大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒ORF2多肽对恒河猴的免疫保护研究

在大肠杆菌中表达的一段戊型肝炎病毒 (HEV)结构蛋白NE2 ,纯化后以弗氏佐剂 ,按0d ,1 0d ,30d的方案 1 0 μg 针的剂量免疫 3只恒河猴 ,在第 2周抗体阳转 ,第 6周时 1只滴度达 1∶1 0 0 0 0 0 ,另 2只滴度 1∶2 0 0 0 0 ,此时以 1 0 6PCR滴度的HEV病毒粪悬液攻击。对照组 3只均出现血清转氨酶 (ALT)升高 ,抗体阳转 ,粪便持续排毒 1月以上 ;疫苗组无一发病 ,未检出非疫苗来源的抗体 ,其中 1只始终未检出粪便排毒 ,另 2只仅出现短暂排毒。以一份NE2免疫后猴血清 (滴度 1∶2 0 0 0 0 )与 1 0 3PCR滴度的病毒混匀后感染 2只恒河猴 ,结果对照组 2只均持续排毒 3周以上 ,抗体阳转 ,1只ALT明显升高 ;而抗体中和组 2只猴始终未检出粪便排毒 ,抗NE2抗体缓慢下降 ,ALT正常。这些结果表明NE2具有良好的免疫原性和免疫保护性 ,有可能成为有效的戊肝疫苗

福建沿海地区人T淋巴细胞白血病病毒1型膜基因的克隆和系统树分析

人T淋巴细胞白血病病毒 1型 (HTLV 1)是最早发现的一种RNA肿瘤病毒。利用HTLV 1基因组长末端重复区 (LTR)或膜基因 (env)序列进行系统树分析 ,可分为C、J、WA、CA和M 5个亚型。为了解我国HTLV 1流行区毒株的主要基因型别 ,从福建莆田地区克隆出 3株HTLV 1的env基因。其序列与已知各亚型代表株进行系统树分析 ,结果表明均为C亚型。首次证实了中国大陆HTLV 1C亚型的存在。该地区地处福建沿海 ,近几个世纪以来对海外人口迁徙频繁。这一地区HTLV 1C亚型的存在是否与目前全球性C亚型的分布有关 ,值得进一步研究

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养

在 10L发酵罐中对戊型肝炎病毒衣壳蛋白在重组大肠杆菌中表达发酵工艺进行了研究 ,用分批培养方法探讨了不同培养基、培养基中磷酸盐浓度和Mg2 + 浓度等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响 ;用分批补料培养研究了不同的补料工艺对菌体生长与重组蛋白表达的影响 ,同时对重组菌诱导时期、诱导持续时间以及不同诱导温度表达包含体在尿素溶液中的溶解性进行了研究。结果表明 ,在优化后的培养基中 ,磷酸盐浓度、Mg2 + 浓度分别为 80mmol L与 2 0mmol L时菌体生长与表达效果较好 ;分批补料培养中 ,37℃培养 9h菌体达到对数期中期 (约 4 5OD6 0 0 )为适宜诱导时期 ,加入终浓度为 1 0mmol LIPTG后诱导 5h ,OD6 0 0 达到 80以上 ,重组蛋白表达量达到2 9 74 % ,为最适收获菌体时间 ;37℃表达的包含体 80 %以上溶解在 4mol L的尿素溶液中 ,最终浓度达到 14mg mL ;10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在 30L发酵罐中进行了放大培养 ,10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在 30L发酵罐上具有可放大性与重复性 ,可以应用于工业生产

中国HTLV-Ⅰ env基因的克隆及Ⅰ+Ⅱ型嵌合基因的原核表达与抗原活性检测

为尽快研制出国产HTLV抗体诊断试剂 ,首先从福建HTLV流行区 1名HTLV感染者外周血细胞中克隆出HTLV Ⅰ的全长膜基因 (env) ,继而结合文献报道、PSA软件的亲疏水性分析和EPI软件的B细胞表位分析数据 ,选择了gp46中段开始延伸至 gp2 1N端 2 12个氨基酸 (aa185～aa396 )的基因 ,并在 3′端通过 (GlySer) 2 与人工合成的HTLV Ⅱ型的型特异性表位区基因嵌合 ,插入原核表达载体 pRSET ,在 E .coli中得到了高效表达 ,目的蛋白产量约占菌体总蛋白的 30 %。通过Triton X10 0洗涤 ,低浓度尿素逐步变性处理 ,8mol/L尿素溶解后纯度在 75 %左右 ,经电泳洗脱纯化 ,最终纯度可达 95 %左右 ,纯蛋白得率约 40 %。经Westernblotting检测 ,该蛋白对 4份HTLV Ⅰ型和 2份HTLV Ⅱ型血清均有较强反应 ,而对 4份阴性血清无反应 ,从而有可能用于研制HTLV抗体诊断试剂盒

大肠杆菌重组颗粒性戊型肝炎疫苗对恒河猴的免疫保护

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒 (HEV)衣壳蛋白ORF2片段HEV 2 39重组蛋白颗粒 ,经铝佐剂吸附后 ,分别以5 μg、1 0 μg和 2 0 μg剂量免疫恒河猴 ,2 8天时以相同剂量加强免疫 1次 ,3周后分别以不同病毒滴度的基因Ⅰ型或基因Ⅳ型HEV静脉攻击。结果 ,加强后 3周 ,3个免疫剂量组猴的抗体几何平均滴度分别为 1∶2 71 75、1∶344 0 9、1∶4 16 0 7,以世界卫生组织参比血清定量 ,则分别为 1 0 98IU/ml,1 35 7IU/ml、1 72 4IU/ml。每个剂量免疫组及对照组各有 3只猴接受 1 0 7病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染 ,对照组 3只猴均被成功感染 ,2只出现肝炎 ;2 0 μg免疫组 3只猴均未被感染 ;1 0 μg和 5 μg免疫组各有 2只猴未被感染 ,另 1只猴出现短暂感染 ,免疫猴均未出现肝炎。 3个剂量免疫组及对照组另外 3只猴 ,接受 1 0 4病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染 ,对照组 3只猴均被感染 ,1只出现肝炎 ;而免疫猴均未被感染 ,也未出现肝炎。 3只 1 0 μg免疫猴和 3只对照猴分别接受 1 0 7病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染 ,对照组均被感染并出现肝炎 ,而免疫组均未出现肝炎 ,有 2只未被感染 ,另 1只被短暂感染。另有 3只 1 0 μg免疫猴和 3只对照猴分别接受 1 0 4病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染 ,对照组均被感染 ,而免疫组均未被感染。这些结果表明 :HE

Green fluorescent protein of the jellyfish Aequorea macrodactyla

【中文摘要】 采用PCR扩增和southern杂交筛选相结合的方法 ,从厦门水域的大型多管水母中分离到了新的绿色荧光蛋白基因 gfpxm ,并在大肠杆菌中进行了表达 .gfpxmDNA序列编码区长为 1 0 4 2bp,包含 3个外显子和两个内含子 ,cDNA编码区全长为71 7bp .gfpxmcDNA与已知野生型Aeqgfp 1 0cDNA长度一致 ,核苷酸同源性为81 9% ,推导的氨基酸序列全长为 2 38个氨基酸 ,与AeqGFP1 0的氨基酸同源性为83 6 % .将 gfpxm克隆至pTO -T7表达载体 ,GFPxm在大肠杆菌BL2 1中的表达量达菌体总蛋白的 50 %左右 .荧光性质和强度分析结果表明 ,GFPxm蛋白的激发峰为 4 76nm ,发射峰为 4 96nm ,荧光量子产率为 1 GFPxm蛋白的荧光很稳定 ,对热、碱性、变性剂和盐等有较强抗性 【英文摘要】 A new green fluorescent protein gene gfpxm was isolated from jellyfish Aequorea macrodactyla in the coastal region of East China Sea by the method of combination of PCR amplification and southern hybridization analysis. The gfpxm gene contains three extrons and two introns spread over 1 042 bp of genomic DNA, the entire coding region of cDNA is 717 bp, being identical to the wild type gfp Aeqgfp10 cDNA in length. The amino acid sequence of GFPxm deduced from the nucleotide sequence is...国家海洋“863”计划领域青年基金资助项目 (819-Q - 06);国家自然科学基金资助项目 (C01040101);福建省自然科学基金资助项目 (C0010001);国家海洋局海洋生物工程重点实验室开放基金资助项目 (HY9703

Construction and Application of an Escherichia coli High Effective Expression Vector with an Enhancer

【中文摘要】 构建的 pTO T7大肠杆菌高效融合表达载体 ,调控序列中有一个Ω序列和一个T7启动子串联 ;多克隆位点 (MCS)包括 8个常用酶切位点 ;可进行融合表达或者非融合表达 ,根据不同的需要加以选择 ;融合蛋白N端为T7g10的 12个起始氨基酸 ,C端为His标签 ;含kan抗性基因作为选择标记。将增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因克隆至 pTO T7载体 ,在E .coli中的表达结果表明 ,融合EGFP达到菌体总蛋白量的 5 0 %以上 ,90 %以上的融合蛋白以可溶性形式存在 ,融合后的EGFP仍保持原有的荧光性质。与同时构建的不含Ω序列的 pT T7载体的表达产量的比较研究结果表明 ,Ω序列在 pTO T7载体中能显著提高表达效率。 【英文摘要】 In this study,we constructed a high effective fusion expression vector in E.coli . This vector,pTO T7,was characterized as: (1) an enhancer from tobacoo mosaic virus (TMV),Ω sequence,was ligated in front of a T7 promoter in the regulatory sequence; (2) the multicloning sites include eight restriction enzyme sites. It can facilitate fusion or non fusion expression; (3) the N terminal of a fusion protein starts with the first 12 amino acids of T7 gene 10,and the C terminal is the hexahistidine tag; (4) ...福建省计委重点攻关课题资助( 96160