人T淋巴细胞白血病病毒 1型 (HTLV 1)是最早发现的一种RNA肿瘤病毒。利用HTLV 1基因组长末端重复区 (LTR)或膜基因 (env)序列进行系统树分析 ,可分为C、J、WA、CA和M 5个亚型。为了解我国HTLV 1流行区毒株的主要基因型别 ,从福建莆田地区克隆出 3株HTLV 1的env基因。其序列与已知各亚型代表株进行系统树分析 ,结果表明均为C亚型。首次证实了中国大陆HTLV 1C亚型的存在。该地区地处福建沿海 ,近几个世纪以来对海外人口迁徙频繁。这一地区HTLV 1C亚型的存在是否与目前全球性C亚型的分布有关 ,值得进一步研究

夏宁邵

张军

张国忠

徐颖潇

杨丰

王颖彬

逄淑强

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#论著#福建沿海地区人 T淋巴细胞白血病病毒 1型膜基因的克隆和系统树分析王颖彬1,张军1,张国忠2,逄淑强1, 徐颖潇1,杨丰1,夏宁邵1( 11 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室, 厦门大学,福建 厦门 361005;21 福建省莆田市中心血站, 福建 莆田 351100)摘要:人 T 淋巴细胞白血病病毒 1 型( HTLV- 1)是最早发现的一种 RNA 肿瘤病毒。利用 HT LV- 1 基因组长末端重复区( LT R)或膜基因 ( env ) 序列进行系统树分析,可分为 C、J、W A、CA和 M 5 个亚型。为了解我国 HTLV-1 流行区毒株的主要基因型别,从福建莆田地区克隆出 3株 HTLV-1 的 env 基因。其序列与已知各亚型代表株进行系统树分析, 结果表明均为 C 亚型。首次证实了中国大陆 HTLV- 1 C 亚型的存在。该地区地处福建沿海,近几个世纪以来对海外人口迁徙频繁。这一地区HT LV- 1 C 亚型的存在是否与目前全球性 C亚型的分布有关, 值得进一步研究。关键词:人类 T 淋巴细胞白血病病毒;亚型; 全球传播中图分类号: R373; Q78   文献标识码: A   文章编号: 1000- 8721( 2000) 03- 0193- 05收稿日期: 2000- 04- 11;修回日期: 2000- 05- 22基金项目:教育部重点科技项目( 99179)作者简介:王颖彬( 1975- ) ,女,江西南昌,硕士研究生, 研究病毒分子生物学。通讯作者:张军, E1mail: Zhangj@ jingxian1xmu1 edu1cn  人 T 淋巴细胞白血病病毒 ( human T - cellleukemia/ lymphotropic virus, HTLV)是最早发现的一种人逆转录病毒,属于逆转录病毒科肿瘤病毒亚科哺乳类 C 型病毒。根据基因组及血清学反应可将其分为人 T 淋巴细胞白血病病毒 1型( HT LV-1)和2 型 ( HT LV-2) , 两型病毒基因组同源性大于60%。H TLV-1主要侵染 T 淋巴细胞, 可引起成人T 细胞白血病 ( ATL)、热带下肢痉挛性瘫痪或HT LV-1相关脊髓病 ( TSP/ HAM ) , 并且在多种自身免疫病患者体内也发现了该病毒的存在。目前已报道的世界各地的 H TLV-1毒株基因组间的差异均极小,核苷酸同源性基本上都在 90%以上, 而且众多研究已清楚地表明 HTLV-1 的变异主要取决于其地理分布, 而基本与其致病性无关。Vidal等[ 1]根据H TLV-1基因组的长末端重复区( LTR) 和膜基因 ( env ) 序列进行系统发生树分析, 将来自日本、中东、美洲 (包括加勒比地区 )、非洲等地区的HT LV-1 大致分为 COSMOPOLITAN ( C 亚型 )、JAPANESE( J亚型)、WEST AFRICAN( WA 亚型)、CENTRAL AFRICAN( CA 亚型)和 MELANESIAN( M 亚型)等 5个亚型。目前我国已发现几个 HT LV-1流行区, 而且不断有一些地区报告了 HTLV 的散发[ 2- 8]。初步明确流行于我国的 HTLV毒株的基因类型,对于研制我国的 HTLV 诊断试剂和疫苗, 制定相应防治策略,以及对深入阐明这一病毒的全球传播途径及起源等,都将有十分重要的意义。材料与方法1 样品的采集及处理  3 例 HTLV- 1 抗体阳性者(分别编号为 S13、S14、S15)来自福建省莆田市的 3 个乡本地长住居民,无出国史, 无受血史 , 未有任何已知的 HTLV 相关疾病症状, 彼此无亲缘关系。S13为男性 , S14、S15 为女性。每例采集静脉血 5ml, 肝素抗凝, 用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞。2 核酸提取  以 TaKaRa 公司的 Dr1GenTLETM基因组DNA 抽提试剂盒提取核酸, 严格按试剂盒操作手册进行, 所得 DNA溶于 500Ll去离子水中, - 20 e 冷冻保存。3 PCR 扩增  参照 HTLV- 1 型 HL1PROP 株序列 ( Gen-Bank Accession Number : M 33896) 设计引物 (表 1) , 扩增HTLV- 1 env 基因的 gp46 片段。以 F1/ R1 为外侧扩增引物,进行第一次 PCR 反应, 反应条件为 94e 预变性 10min;94 e 50s, 52e 50s, 72 e 90s, 25 个循环; 72e 后延伸 10min。取 01 5Ll第一次 PCR 产物, 用 F2/ R2 作为内侧引物进行第二次 PCR反应, 反应条件 : 94e 预变性 5min; 94 e 50s, 55 e50s, 72 e 90s, 25个循环; 72 e 后延伸 10min。4 PCR 产物纯化、克隆及测序  第二次 PCR 产物经 11 2%琼脂糖凝胶电泳分离, 对照标志物无误后,切下特异扩增带,用胶回收试剂盒(上海华舜公司)回收纯化扩增产物,克隆入第 16卷  第 3期2 0 0 0 年 9 月            病   毒   学   报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY            Vol. 16   No. 3Sept .  2 0 0 0pM D18- T 载体( T aKaRa公司 ) , 转化大肠杆菌 DH5A株。由上海博亚生物公司进行双向序列测定。表 1  PCR 引物Table 1  Primers used for PCRPrimer Sequence( 5c- 3c) Posit ion in genomeF1 AGCCGCCAGT GGAAAGGACCA 5031- 5051R1 CCTCGTCTGTT CTGGGCAGCATAC 6344- 6321F2 AT GGGT AAGTT TCTCGCCAC 5203- 5222R2 GGAGACAAGCCAGGCCGC 6168- 61515  DNA序列同源性比较及系统树分析  以 DNASIS 软件( Hitachi Softw ar e Eng ineering Co1 1992)进行同源性比较。以CLUSTAL X软件用 Neighbour Joining 方法进行系统发生树分析,以 T reeV iew 软件( 11 512 版)绘制发生树图。结   果1  HTLV-1 env gp46基因的克隆从福建沿海 HT LV 流行区 3 例 HTLV 感染者淋巴细胞中提取染色体 DNA,以巢式及半巢式 PCR扩增 HTLV的 gp 46基因,如果如图 1所示。2、3、4这 3条泳道在 966bp处有一条清晰的带,与预期结果相同。回收 PCR产物,克隆入 T 载体, 测序后证实包含HT LV- 1型 env 区gp 46的全编码区。图 1  PCR扩增的 env 基因片段Figure 1 The env gene fr agment amplified by PCRLane 1. DNA marker DL 2, 000( TakaRa) ; Lane 2- 4. en v gp 46 genef ragment ; Lane 2. Sample S 13; Lane 3. S ample S 14; Lane 4. S ampleS 15.2  同源性分析S13、S14及 S15的核苷酸和氨基酸序列均高度同源, 而且与 5个基因亚型代表株间的核苷酸及氨基酸同源性也均在 90%以上, 而其中又以与 C 亚型、J亚型的同源性最高(表 2)。各毒株间 gp46 蛋白的氨基酸变异较核苷酸为小, 而且均匀分布于整个序列中(图 2)。表 2  福建 HTLV-1 株与HTLV-1 各亚型代表株 env gp46 片段序列的同源性比较Table 2  Homology compar ison of env gp46 sequence o f FujianHTLV- 1 w ith t hat of HT LV- 1 subtype representa-t ive strainsS train* S 13 S 14 S15 C J WA CA MS14 9915& -9910& -S15 9818 9819 -9914 9917 -C 9912 9913 9815 -9914 9917 9914 -J 9813 9813 9811 9814 -9814 9914 9910 9910 -W A 9717 9718 9717 9719 9715 -9718 9811 9718 9814 9715 -CA 9617 9618 9711 9711 9617 9617 -9615 9618 9615 9712 9618 9516 -M 9217 9311 9215 9217 9117 9213 9212 -9419 9512 9419 9516 9416 9410 9217 -  * : GenBank Accession Number: S13, AF226596; S 14,AF226594; S15, AF226595; C, AF003009; J, M33896; WA,D13784; CA, L26586; M , L02534. & : T he upper row is nucleiotidehomology, and the low er row is amino acid homology.3  系统树分析用 S13、S14、S15 和 5 个亚型的代表株的完整gp 46基因序列进行系统发生树分析, 结果显示S13、S14和 S15均属于 C亚型(图 3)。#194# 病   毒   学   报                  16 卷  图 2 福建 HTLV- 1 株与 HTLV- 1 各亚型代表株 envgp 46 氨基酸序列的同源性比较Figure 2  Homology compar ison o f env gp46 amino acidsequence of Fujian HTLV- 1 w ith that ofHTLV- 1 subtype representative strains图 3 福建地区HTLV- 1毒株序列与 5 种亚型代表株的系统树分析Figure 3  Phylogenet ic analysis of Fujian HT LV- 1 se-quences ( S13, S14, S15) w ith five subtype rep-resentative strain sequencesGenBank Accession Number: S13, AF226596; S 14, AF226594;S15, AF226595; Subtype C: C 1, AF003009; C2, L 76064; Sub-type J: J1, M33896; J2, M37301; Subtype WA: W A, D13784;Subtype Ca: CA, L26586; Subtype M: M , L 02534.讨   论迄今世界各地报道的 HT LV-1毒株间的基因组变异极小, 核苷酸同源性均在 90% 以上, 这是HT LV 与其它各种已知病毒相比的一个显著特征。这一特征使之基本上可以通过特定感染人群的迁移历程而追踪其全球传播途径及起源[ 9]。Vidal等[ 1]、Gesain等[ 10]根据 H TLV-1基因组的长末端重复区( LTR)以及 env 基因序列进行系统树分析,将来自日本、中东、美洲(包括加勒比地区)、非洲等地区的HTLV-1大致分为 C、J、WA、CA 和 M 5个亚型。J亚型集中于日本, WA 亚型分布于西非, CA 亚型分布于中非, M 亚型见于巴布亚新几内亚、所罗门群岛和澳洲土著人中,而 C亚型则在中东、日本、美洲(包括加勒比地区)以及非洲某些地区均不少见, 表现出一种与其它亚型明显不同的分布特点。由于 C亚型在多个地区与其它当地亚型共存, 但仍保持系统树上的明显独立分枝, 因此推测 C 亚型的全球性分布是因某一携带病毒的共同祖先人群在近几百年内的远距离迁移造成的, 但其源头究竟是何处迄今尚无定论。在各亚型之间, C亚型与 J亚型的距离最近,在系统树中的分界较不稳定, 迄今仍有许多学者将 C、J两个亚型视为一个亚型下的两个亚群, 因此推测此两亚型可能是由某一共同祖先在不是十分遥远的过去分别进化而来的。Vidal等[ 11]发现 J亚型基本局限于日本及夏威夷的日本后裔。在日本还有25%左右的 C亚型,但有趣的是这些 C亚型几乎完全集中于日本南部的几个岛屿,而不象 J亚型分布于全日本各个流行区,推测日本的 C 亚型可能是在近百年内才由其它地方传入。Chen 等[ 12]对台湾地区H TLV-1进行了分子遗传学研究, 结果在几个部落的台湾高山族土著居民中均未发现 HT LV-1感染,而岛内大陆移民及后裔中 H TLV-1 感染率在1%左右,其中 C 亚型占 70%以上, 其余为 J亚型;在与大陆仅隔数海里的金门岛, H TLV-1感染率为0173% ,全部是 C亚型, 因此认为台湾的 H TLV-1C亚型更可能是由大陆传入而非日本。本研究从与台湾隔海相望的福建沿海地区克隆出 3株 HTLV-1的 env 基因, 其序列经系统发生树分析, 确认为HTLV-1 C 亚型, 从而证实了中国大陆 HT LV-1 C亚型的存在。由于台湾岛及金门岛内居民的大多数都是福建沿海地区居民的后裔, 因此本研究为,Chen等的推测提供了进一步的证据。本研究所处地区毗邻明朝郑和七下西洋的出发地, 同时也是清末海外华工的主要输出地之一, 还是明朝倭寇出没之地,在近几个世纪以来对外人口迁徙频繁。另外,从地理位置来看, 日本 C亚型病毒分布地区基本上都与中国临近,是否 C 亚型病毒的全球性传播与此有关? 中国是否是 C 亚型的源头? 目前在我国广#195# 3 期       王颖彬等: 福建沿海地区人 T 淋巴细胞白血病病毒 1 型膜基因的克隆和系统树分析东、黑龙江、辽宁等地都已发现了多例 H TLV-1 感染者和 ATL 患者[ 5- 7] , 马来西亚、菲律宾等也有HT LV 发现[ 13, 14] , 因此对这些地区以及山东沿海、朝鲜半岛、东南亚其它各国等地的 HT LV-1的进一步病毒分子遗传学研究, 将会对进一步判断这种可能性提供更多的重要证据。HT LV-1的传播途径与 HIV 类似, 可以通过哺乳或宫内垂直传播,同时还可通过输血、性接触、静脉药瘾者共用针头等进行水平传播。早在 80年代,日本、美国等就陆续发现了几例由于输入 HTLV 感染血液而导致的 HAM / TSP 患者, 因此日本、美国、法国、澳大利亚、香港、台湾及其他许多国家和地区都已陆续将 HTLV 感染检测列为献血员及血制品必检项目之一。我国也曾在福建沿海地区、广东沿海及内陆地区发现了 HT LV 流行区,人群感染率在1%左右[ 2, 5]。近年来在国内其他多个地区也陆续发现了HT LV 的散在流行, 例如: 黑龙江省在 1996年进行的抽样调查中发现采浆人群中 H TLV 感染率明显高于普通人群[ 6]; 河南省曾发现一例疑似受血导致的H TLV 感染[ 8] ; 福建省福清市医院对 201例血液病患者进行检测, 结果 24例阳性, 阳性率高达 1119%,据分析与血液病患者输血频繁有关[ 3]。由于 H TLV 感染后果的严重性, 随着我国各地HT LV 感染的陆续发现, 如何进一步加强对我国HT LV 相关研究及制定相应的对策已成为一个迫切需要认真考虑的问题。参考文献:[ 1] Vidal A, Gessain A, Yoshida M , et al. Phylogenetic classification ofHTL V-1 genotypes in 5 major molecular and geographical subtypes[ J ] . J Gen Virol, 1994, 75: 3655- 3666.[ 2]吕联煌,叶榆生,黄淑华,等 1 福建沿海地区人类 T 淋巴细胞白血病病毒小流行区的发现[ J]1 中华血液学杂志, 1989, 10: 2251[ 3]董德华,陈武,陈国敏, 等 1 血液病患者感染人类 T 细胞白血病病毒的状况[ J]1 中华微生物学和免疫学杂志, 1997, 17( 2) : 1011[ 4]马一盖,陈国敏,汪晨,等 1 中国人成人 T 细胞白血病/淋巴瘤 12例临床分析[ J]1 中华内科杂志, 1999, 38( 4) : 251- 2541[ 5]杨棉华,陈国敏,余秀葵,等 1 广东省人群中人嗜 T 细胞病毒 Ñ型感染的血清流行病学调查及其与人类疾病的关系[ J]1 中华实验与临床病毒学杂志, 1997, 11: 56- 581[ 6]白立石,高飞,黄秉诚,等 1 黑龙江省四市、县单采浆人群H IV 及H TLV- 1感染状况初步调查[ J] 1 中国性病艾滋病防治, 1997, 3( 6) : 2581[ 7]董文瑞,莲井和义,屋敷伸治,等 1 中国沈阳与日本鹿儿岛地区恶性淋巴瘤HT LV- Ñ gp46的免疫组织化学研究[ J]1 中华血液学杂志, 1996, 17( 11) : 582- 5841[ 8]闫均炎,魏予风,马仁安 1 老年人群 T 淋巴细胞白血病病毒抗体普查分析[ J]1 中国卫生检验杂志, 1998, 8: 300- 3011[ 9] Gessain A, Gallo R, Franchiani G. Low degree of HTLV-1 gen eticdrift in v iv o as a m ean of monitoring viral t ransmission and move-ment in ancient human populat ion [ J] . J Virol, 1992, 66: 2285 -2295.[10] Gesain A, de T he G. Molecular epidemiology of H TLV - 1/ Ò[ M ] . Takatsuki K. Adult T - Cell L eukaemia [ A] . Ox ford: Ox-ford Un iversity Press, 1994, 139- 161[ 11] Vidal A, Gessain A, Yoshida M , et al. Molecular epidemiology ofHTLV type I in Japan: evidence for tw o dist inct ancestral lineagesw ith a particular geographical distribut ion [ J ] . AIDS Res H umRetroviruses, 1994, 10: 1557- 1577.[ 12] Chen Y, T ing S, Lee C , et al. Community- based molecular ep-idemiology of H TLV type I in Taiw an and Kinmen: implicat ion ofthe origin of the cosmopolitan subtype in northeast Asia[ J] . AIDSRes Hum Retroviruses, 1999, 15: 229- 237.[ 13] Yap S, Peh S , Chan L , et al. HT LV- I ant ibody study in normalindividuals and unselected hospital patients in Malaysia[ J] . South-east Asian J T rop Med Public Health, 1992, 23: 26- 29.[ 14] Ishida T , Yamamoto K, Omoto K, et al. A seroepidemiologicalsurvey of HT LV- 1 in th e Philippines[ J ] . Int J Epidemiol, 1988,17: 625- 628.#196# 病   毒   学   报                  16 卷  The Cloning and Phylogenetic Analysis of Envelope Gene of HTLV-1 Virus fromthe Coastal Region of FujianWANG Ying-bing1, ZHANG Jun1* , ZHANG Guo-zhong2, PANG Shu-qian1,XU Ying-xiao1, YANG Feng1, XIA Ning-shao1( 1. T he K ey L aboratory of M inistry of Educat ion f or Cell Biology and T umor Cel l Engineering , X iamen Univ ersi ty ,X iamen 361005, China; 2. The Centr al B lood Bank of Pu tian, F uj ia n, Pu tia n 351100, China)Abstract: T he human T-cell leukemia/ lymphotropic v irus type 1(H TLV-1) belongs to the Oncovirinae subfamilyof ret roviruses. Phylogenet ic analysis of the long term inal repeat ( LT R) and env gene of HTLV-1 gave a phy loge-net ic classification of HTLV-1 genotypes into f ive major molecular subtypes: Cosmopolitan( C) , Japanese( J) ,West African( WA) , Central African( CA) , and Melanesian( M) . In order to understand the major genotype ofHT LV-1 prevalent in China, HTLV-1 env gene w as amplif ied by PCR and sequenced from peripheral bloodlym phocy ts of three HTLV-1 carriers in the Put ian reg ion of Fujian Province. Phy logenet ic analysis was donew ith env sequences of three isolates and the representative st rains of five major HT LV-1 subtypes. The resultsshowed that all the three isolated H IV-1 strains w ere grouped into subtype C. Thus, the existence of HTLV-1subtype C virus in China mainland was first ly conf irmed. Since Putian region is located along the coast of Fu-jian, where oversea em igration have been frequent in recent several centuries, w hether it associated w ith theg lobal disseminat ion of HT LV-1 subtype C deserves further study .Key words: human T-cell leukemia/ lymphotropic virus; subtype; global dissem inat ion* Corr esponding author : ZHA NG Jun. E - mai l : zha ngj @j ingxia n. xmu . ed u . cn#197# 3 期       王颖彬等: 福建沿海地区人 T 淋巴细胞白血病病毒 1 型膜基因的克隆和系统树分析

福建沿海地区人T淋巴细胞白血病病毒1型膜基因的克隆和系统树分析

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21279/%e7%a6%8f%e5%bb%ba%e6%b2%bf%e6%b5%b7%e5%9c%b0%e5%8c%ba%e4%ba%baT%e6%b7%8b%e5%b7%b4%e7%bb%86%e8%83%9e%e7%99%bd%e8%a1%80%e7%97%85%e7%97%85%e6%af%921%e5%9e%8b%e8%86%9c%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e7%9a%84%e5%85%8b%e9%9a%86%e5%92%8c%e7%b3%bb%e7%bb%9f%e6%a0%91%e5%88%86%e6%9e%90.pdf?sequence=1&isAllowed=y

福建沿海地区人T淋巴细胞白血病病毒1型膜基因的克隆和系统树分析

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