生產改質幾丁質之方法及應用該改質幾丁質純化幾丁質酵素之方法

本發明係一種純化幾丁質酵素之方法，其係包括提供經發酵改質的幾丁質，使發酵改質的幾丁質與幾丁質酵素接觸，使幾丁質酵素吸附於發酵改質的幾丁質形成複合物，及自複合物中分離幾丁質酵素。本發明另相關於一種生產發酵改質之幾丁質的方法，其係包括提供可生產幾丁質酵素的微生物與幾丁質進行發酵，及自發酵液中分離幾丁質。本發明另相關於新穎微生物類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)

應用Peanibacillussp.發酵修飾幾丁質進行幾丁酵素之純化研究

The affinity chitin chromatography with fermentation-modified chitin was employed for purification of chitinase. For studying chitinase adsorption capacity, factors such as loading temperature, pH and elution solutions were investigated. The optimal loading conditions were found at 15℃, pH5, and elution conditions were: 0.02M acetic acid solution. Under this condition, the obtained specific chitinase activity gave a purification fold of 15.64. Furthermore, for investigating the mechanism of increase in the purification fold, it was found small particle size of chitin had a better adsorption capacity. Whereas, with the same chitin particle size of mesh 80, it was observed that enzyme-modified chitin gave an increase of 20.6% chitinase adsorption capacity and the fermentation-modified chitin yielded an increase of 54.2% chitinase adsorption capacity. By observing the structural changes of enzyme-modified and fermentation-modified chitin by SEM, it was found the chitin surface became porous & branching structure, which might reveal more active site & reduce the steric hinderance to the adsorption of chitinase.本研究以經發酵後的幾丁質為載體利用幾丁質對幾丁酵素的親合性來進行純化，即為幾丁質親合層析。文中探討幾丁酵素吸附在幾丁質上之最適化條件，例如：酵素液載入時的溫度、pH，與幾丁質及膠態幾丁質來進行吸附能力的比較。從實驗得知在15℃、pH 5條件下可得到最高酵素吸附量，且吸附能力以經發酵修飾後的幾丁質較佳，使用沖提液以0.01M醋酸水溶液下為佳，所得之幾丁酵素純化倍數為15.64倍。 第二階段之研究內容為探討幾丁質的改質情形。實驗發現幾丁質的顆粒越小，其酵素吸附量越高；相同的幾丁質粒徑情況下，經酵素修飾後的幾丁質之酵素吸附量，較未修飾者高20.6%。而利用經發酵修飾後幾丁質酵素吸附量，則約可提升54.2%。以SEM圖觀察幾丁質經酵素及發酵修飾後的表面，發現幾丁質由平滑的表面變成多孔狀的結構，推測為幾丁質的直鏈結構，因此推知，經發酵修飾之幾丁質在吸附幾丁酵素時減少了立體障礙，進而提高對酵素的吸附量。摘要 I Abstract II 目錄 III 表目錄 VII 圖目錄 VIII 第一章 前言 1 第二章 文獻回顧 4 2.1 幾丁質(chitin)的介紹: 4 2.2 幾丁質酵素的分類 7 2.3 幾丁質酵素的天然分布 8 2.3.1 植物之幾丁質酵素 8 2.3.2微生物之幾丁質酵素 10 2.3.3 細菌幾丁質酵素的結構與功能 11 2.3.4 動物之幾丁質分解酵素 16 2.4 幾丁質酵素之應用 16 2.4.1 植物病蟲害的控制 17 2.4.2 真菌原生質體的技術 18 2.4.2 單細胞蛋白質（SCP）的生產 18 2.4.3乙醯幾丁寡糖的產生 19 2.5 N-乙醯幾丁寡糖製備方法 20 2.5 乙醯幾丁寡糖的應用 21 2.5.1 生理效用 21 2.5.2 食品方面 23 2.5.3 農業方面 23 2.6 幾丁質酵素在演化上的分類 24 2.7 幾丁質酵素受質結合區對幾丁質的吸附 24 2.8 利用幾丁質的純化 26 第三章 實驗方法 30 3.1實驗材料 30 3.1.1菌種 30 3.1.2培養基組成 30 3.1.3實驗藥品 32 3.1.4實驗器材 32 3.2 實驗流程 32 3.2.1發酵流程: 32 3.2.3幾丁質的製備 33 3.2.3幾丁酵素的製備 33 3.2.4 批次吸附實驗 34 3.2.5 膠態幾丁質的製備 34 3.2.6 膠態幾丁質的定量 35 3.2.7 幾丁質粉末的製備 35 3.3分析方法 35 3.3.1 蛋白質濃度的量測 35 3.3.2 幾丁酵素活性分析 37 3.3.3 還原醣分析流程 38 3.3.4 電泳分析 39 第四章 結果與討論 43 4.1 硫酸銨沉澱 43 4.2 各種幾丁質的比較 45 4.3最適吸附條件 48 4.3.1溫度對吸附的影響 48 4.3.2 pH值對吸附的影響 51 4.4影響幾丁質吸附的因素探討 54 4.4.1幾丁質的顆粒大小 54 4.4.2酵素修飾與發酵修飾的幾丁質 55 4.4.3 SEM的觀察 57 4.4.4 電泳圖的觀察 59 4.4.5 Langmuir isotherm的證明 61 4.5 脫附的條件探討 64 4.5.1各種緩衝液的脫附能力 64 4.5.2 檸檬酸緩衝液的抑制及脫附情形 68 4.5.3 醋酸水溶液的脫附探討 72 第五章 結論與展望 75 5-1 結論 75 5-2未來展望 76 表目錄 表2-1 文獻上利用幾丁質的純化 28 表3-1 實驗使用之培養基配方 31 表3-2 DNS試劑之組成 39 表3-3 下層膠的比例 40 表3-4 上層膠的比例 41 表3-5 染色劑的成分 42 表3-6 脫色劑的成分 42 表4-1 Langmuir isotherm的吸附常數及最大吸附量 64 表4-2 緩衝液對CM-CHITIN-RBV的影響 68 表4-3 緩衝液對酵素液活性的影響 69 圖目錄 圖2-1 幾丁質，幾丁聚醣以及纖維素之化學結構 5 圖2-2 幾丁質三種型態 7 圖4-1 硫酸銨劃分圖 43 圖4-2 硫酸銨劃分電泳圖 44 圖4-3 不同幾丁質的活性吸附量 46 圖4-4 不同幾丁質的吸附比活性 46 圖4-5 各種幾丁質所產生的還原醣量 47 圖4-6 不同溫度下的活性吸附量 49 圖4-7 不同溫度下的吸附比活性 49 圖4-8 不同溫度下所產生的還原醣量 50 圖4-9 不同pH下的活性吸附量 51 圖4-10 不同pH下的吸附比活性量 52 圖4-11 不同pH下發酵液所產生的還原醣 53 圖4-12 不同顆粒大小幾丁質的吸附量 54 圖4-13 酵素液處理時間及經發酵處理後的幾丁質吸附比較 56 圖4-14 幾丁質的SEM圖 57 圖4-15 經酵素處理2h的幾丁質SEM圖 58 圖4-16 經發酵處理幾丁質的SEM圖 58 圖4-17 經不同幾丁質吸附後之酵素液 60 圖4-18 幾丁質的(Ce/qe)對Ce圖 63 圖4-19 經發酵處理幾丁質的(Ce/qe)對Ce圖 63 圖4-20 脫附後的Recovery 65 圖4-21 脫附後的Purification fold 65 圖4-22 經各種緩衝液脫附後的電泳圖分析 67 圖4-23 檸檬酸緩衝液對酵素液的抑制情形 70 圖4-24 不同檸檬酸緩衝液濃度脫附的Recovery 71 圖4-25 不同檸檬酸緩衝液濃度脫附的Purification fold 71 圖4-26 不同醋酸水溶液濃度脫附的Recovery 72 圖4-27 利用各種醋酸水溶液濃度脫附後的電泳圖分析 74 圖4-28 不同醋酸水溶液濃度脫附的Purification fold 7

普適AI服務：數位轉型趨勢下的智慧型代理人--普適AI服務：數位轉型趨勢下的智慧型代理人(1/2)

[[abstract]](1)精進自適應AI核心技術，探索通用型機器學習、遷移學習、零學習等技術，適應多變智慧服務應用。(2)強化AI可解釋及可信任性，嵌入信任度於模型設計、開發可調式及可驗證機制、運用虛實整合找出AI可解釋性。(3)創建TwinsTalk數位孿生平台，透過即時資料隨時監督實體表現，擴大智慧服務並帶動數位轉型及產業變革。(4)以AI為基礎的人機互動介面，強化功能、應用、安全及協助多元任務。(5)場域驗證：以實體及虛擬之智慧型代理人於協作陪伴、智慧城鄉、金融服務等場域實作。(6)建立聯邦資料治理與管理平台FedDGM：設計本地與伺服器端分開的治理機制，資料與模型進行迭代管理，達到完善資料治理與分享。[[note]]科技部[[note]]2021-11-01～2022-10-3