나노디스크 및 나노베지클에 내장된 후각 수용체의 최적의 생산과 냄새의 패턴 및 시각화에 대한 응용

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 공과대학 화학생물공학부, 2022. 8. 박태현.G protein-coupled receptors (GPCRs) are the most intensively studied for screening drug targets. Especially, class A GPCR including olfactory receptor (OR) which accounts for about 85 % of GPCR family is more important for codifying and screening target receptors. There are about 400 kinds of ORs in human olfactory system. The interactions between ORs and odorants generate signals which are transferred to brain as combinatorial codes. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli with a limited number of ORs because of widespread OR-driven modulation such as inhibition and enhancement in peripheral olfactory coding. Since the sense of smell perceives the complex external world as a pattern, many studies have been conducted to mimic the response of ORs. In particular, protein-based nanobiosensor is expected as a platform to mimic the olfaction because it has advantages such as mass production, ease of reuse, and low cost. However, reconstitution of the structure of GPCRs is challenging because almost all GPCRs produced in E. coli system are expressed as inclusion bodies. For this reason, reconstitution techniques have been developed to recover the functionality of GPCRs, such as the use of detergent micelles, nanovesicles, bicelles and nanodiscs (NDs). Among these materials, NDs have been considered the most effective reconstitution material because of their stability in various environments and their functional lifetimes. In this thesis, ORs were produced in E. coli system with high productivity and reconstituted to ND or nanovesicle forms. Then the functional reconstituted ORs were applied to monitoring meat freshness/spoilage, disease diagnosis and practical colorimetric sensor. First, OR was overexpressed by coexpressing effector genes, such as djlA, the membrane-bound DnaK cochaperone, and rraA, inhibitor of the mRNA-degrading activity of E. coli RNase E. The E. coli strains coexpressing DjlA or RraA suppressed protein-induced toxicity and overexpressed the ORs. By controlling the molar ratio of OR, membrane scaffold protein, and phospholipid, ND of appropriate size were made, and high-purity ND could be purified. OR-embedded NDs showed stability to various temperature and storage time. Second, Human ORs which bind to gastric cancer and halitosis biomarkers were successfully reconstituted to ND form and purified. The NDs had various patterns to artificial saliva samples because NDs had various binding affinities to target molecules. Through principal component analysis of various patterns for artificial saliva samples, it was possible to distinguish between healthy control samples and patient samples. Third, trace amine-associated receptors (TAARs), TAAR13c and TAAR13d, were successfully overexpressed in E. coli system and reconstituted to ND form. These NDs were utilized for development of ND-based BE-nose for monitoring meat freshness. The ND-based BE-noses was successfully performed towards diverse on-site and the various real samples and could be used to monitor freshness of meat. Lastly, human OR1A2 (hOR1A2) was reconstituted into detergent micelle and it was used for development of colorimetric sensor detecting geraniol. Polydiacetylene (PDA) was used as secondary transducer for visualization of responses of OR. The structural and functional properties of the hOR1A2 were maintained when it was embedded in PDA/lipid nanovesicles. The hOR1A2 embedded in PDA/lipid nanovesicle caused a color transition from blue to purple when it reacted with geraniol, whereas there was no color transition when it reacted with other molecules. In this study, various ORs were successfully reconstituted with ND or nanovesicles. The reconstructed OR is expected to be applied to food freshness monitoring, disease diagnosis by pattern analysis, and practical colorimetric sensors.G 단백질 연결 수용체 (GPCR)는 약물 표적 스크리닝을 위해 가장 집중적으로 연구되는 단백질이다. 특히, GPCR 계열의 약 85%를 차지하는 후각 수용체 (OR)를 포함하는 클래스 A GPCR은 표적 수용체를 코드화하고 스크리닝하는 데 더 중요하다. 인간의 후각 시스템에는 약 400 종류의 OR이 있다. OR과 냄새 물질 사이의 상호 작용은 패턴의 조합으로 뇌에 전달되는 신호를 생성한다. 인간은 말초 후각 코딩의 억제 및 향상과 같은 광범위한 OR에 의한 조절로 인해 제한된 수의 OR로도 1조개 이상의 후각 신호를 구별할 수 있다. 후각은 복잡한 외부 세계를 패턴으로 인식하기 때문에 OR의 반응을 모방하기 위해 많은 연구가 수행되었다. 특히, 단백질 기반 나노바이오센서는 양산성, 재사용 용이성, 저비용 등의 장점이 있어 후각을 모방하는 플랫폼으로 기대된다. 그러나 GPCR 구조의 재구성은 대장균 시스템에서 생성되는 거의 모든 GPCR이 봉입체로 발현되기 때문에 어려운 일이다. 이러한 이유로 세제 미셀, 나노베지클, 바이셀 및 나노디스크 (ND)와 같은 GPCR의 기능을 복구하기 위한 재구성 기술이 개발되었다. 이들 물질 중 ND는 다양한 환경에서의 안정성과 기능적 수명 때문에 가장 효과적인 재구성 물질로 여겨져 왔다. 본 논문에서는 대장균 시스템에서 높은 생산성으로 OR을 생산하여 나노디스크 또는 나노베지클 형태로 구조를 재구성하였다. 그런 다음 기능적으로 재구성된 OR을 육류 신선도/부패 모니터링, 질병 진단 및 실용적인 비색 센서에 적용했다. 첫째, OR은 djlA, 막 결합 DnaK cochaperone 및 rraA, E. coli RNase E의 mRNA 분해 활성 억제제와 같은 이펙터 유전자를 공동 발현함으로써 과발현되었다. DjlA 또는 RraA를 공동 발현하는 대장균 균주는 단백질 발현에 의한 독성을 억제하고 후각 수용체를 과발현했습니다. 후각 수용체, 막 지지체 단백질, 인지질의 몰비를 조절하여 적절한 크기의 ND를 만들고 고순도 ND를 정제할 수 있었다. 후각 수용체가 내장된 ND는 다양한 온도 및 보관 시간에 대해 안정성을 보였다. 둘째, 위암 및 구취 바이오마커에 결합하는 인간 OR은 ND 형태로 성공적으로 재구성되고 정제되었다. ND는 표적 분자에 대한 다양한 결합 친화성을 가졌기 때문에 인공 타액 샘플에 대한 다양한 패턴을 가졌다. 인공 타액 샘플에 대한 다양한 패턴의 주성분 분석을 통해 건강한 대조군 샘플과 환자 샘플을 구별할 수 있었다. 셋째, 미량 아민 관련 수용체 (TAAR), TAAR13c 및 TAAR13d가 대장균 시스템에서 성공적으로 과발현되었고 ND 형태로 재구성되었다. 이러한 ND는 육류 신선도를 모니터링하기 위한 ND 기반 전자 코의 개발에 활용되었다. ND 기반 전자 코는 다양한 현장 및 실제 샘플에 성공적으로 작동되었으며 육류의 신선도를 모니터링하는 데 사용할 수 있었다. 마지막으로 인간 OR1A2 (hOR1A2)를 세제 미셀로 재구성하여 제라니올을 감지하는 비색 센서 개발에 활용하였다. 폴리다이아세틸렌 (PDA)은 후각 수용체의 반응을 시각화하기 위한 2차 변환기로 사용되었다. hOR1A2의 구조적 및 기능적 특성은 PDA/지질 나노베지클에 내장되었을 때 유지되었다. PDA/지질 나노베지클에 내장된 hOR1A2가 geraniol과 반응할 때 파란색에서 보라색으로 색상 전이를 일으킨 반면 다른 분자와 반응할 때는 색상 전이가 없었습니다. 이 연구에서는 다양한 OR이 ND 또는 나노베지클로 성공적으로 재구성되었다. 재구성된 OR은 식품 신선도 모니터링, 패턴 분석에 의한 질병 진단 및 실용적인 비색 센서에 적용될 수 있을 것으로 기대가 된다.Chapter 1 Research background and objective 15 Chapter 2 Literature review 20 2.1 Olfaction 22 2.1.1 Olfactory system 21 2.1.2 Olfactory receptors 25 2.1.3 Patterns of odorants 29 2.2 Nanobiosensor 32 2.2.1 Nanobiosensor system 32 2.2.2 Components for the nanobiosensor 35 2.2.3 Nanobiosensor detecting smell 37 2.3 Biomarkers in disease and food spoilage 44 2.3.1 Gastric cancer 44 2.3.2 Halitosis 47 2.3.3 Meat spoilage 49 2.4 Expression of GPCR in E. coli system 50 Chapter 3 Experimental procedures 52 3.1 Materials 53 3.2 Gene Cloning . 54 3.3 Expression 54 3.3.1 Expression of olfactory receptors in E. coli. 54 3.3.2 Expression of membrane scaffold protein in E. coli 56 3.3.3 Expression of olfactory receptors in HEK-293T cell 57 3.4 Purification. 57 3.4.1 Purification of olfactory receptors. 57 3.4.2 Purification of membrane scaffold protein 58 3.5 Functional reconstitution of olfactory receptors 59 3.5.1 Nanodisc 59 3.5.2 Detergent micelle. 60 3.5.3 Polydiacetylene/Lipid nanovesicle 61 3.6 Characterization . 61 3.6.1 Nano-glo dual luciferase assay 61 3.6.2 SDS-PAGE analysis 62 3.6.3 Dynamic light scattering 63 3.6.4 Circular dichroism . 63 3.6.5 Tryptophan fluorescence quenching assay 63 3.7 Immobilization of olfactory receptor-embedded nanodisc on graphene 64 Chapter 4 Enhancement of olfactory receptor production in E. coli system and characterization of olfactory receptor-embedded nanodiscs. 66 4.1 Introduction 67 4.2 Expression and purification of olfactory receptor in E. coli system 69 4.3 Purification and size analysis of olfactory receptor-embedded nanodiscs. 73 4.4 Stability of immobilized olfactory receptor-embedded nanodiscs. 77 4.5 Conclusions 82 Chapter 5 Development of nanodisc-based bioelectronic nose using trace amine-associated receptors for monitoring meat freshness/spoilage . 84 5.1 Introduction 85 5.2 Characterization of TAARs 87 5.3 Performance of nanodisc-based bioelectronic nose in the liquid phase. 91 5.4 Gas sensing performance of bioelectronic nose and its application to meat spoilage 97 5.5 Measurements of real samples using TAAR nanodisc-based bioelectronic nose 99 5.6 Conclusions 104 Chapter 6 Pattern analysis for gastric cancer biomarkers using human olfactory receptor-embedded nanodiscs . 105 6.1 Introduction 106 6.2 Affinities of human olfactory receptor-embedded nanodiscs to gastric cancer biomarkers 108 6.3 Patterns for gastric cancer biomarkers in artificial saliva 112 6.4 Principal component analysis for artificial saliva samples 115 6.5 Conclusions 117 Chapter 7 Pattern analysis for halitosis biomarkers in artificial saliva using olfactory receptor-embedded nanodiscs 118 7.1 Introduction 119 7.2 Characterization of olfactory receptor-embedded nanodiscs. 120 7.3 Patterns for halitosis biomarkers in artificial saliva. 122 7.4 Principal component analysis for artificial saliva samples 125 7.5 Conclusions 127 Chapter 8 Visual detection of geraniol using human olfactory receptor embedded in polydiacetylene/lipid nanovesicle 128 8.1 Introduction 129 8.2 Functionality of hOR1A2 embedded in detergent micelle and PDA/lipid nanovesicle. 130 8.3 Structural assay of hOR1A2 embedded in detergent micelle and PDA/lipid nanovesicle. 133 8.4 Size analysis and morphology of hOR1A2 embedded in PDA/lipid nanovesicle. 135 8.5 Photoluminescence intensity of hOR1A2 embedded in PDA/lipid nanovesicle. 137 8.6 Conclusions 141 Chapter 9 Overall discussion and further suggestions. 142 Bibliography . 147 국문초록 157박

Study to compare T2 sympathetic block by clipping with T2 sympathicotomy in the palmar hyperhidrosis.

의학과/석사[한글] 다한증의 수술방법으로 신경절을 절단하지 않고 신경전도(conduction)의 전달(transmission)을 방해 또는 차단하는 방법으로 압력(compression force)을 이용한 연구가 보고되었다. Ligaclip Alloport Endoscopic Clip(Ethicon, Inc., NJ, USA)을 사용하여, 제2번 흉부 교감신경절을 차단(blockade)함으로써 보상성 발한을 가역적 재수술(reversible operation)로 수술 전 상태로 회복이 가능하다는 장점과 수술 후 발생되는 문제점을 개선하여 다한증의 새로운 치료 방법으로 제시하고자 본 연구를 시행하였다. 연세대학교 의과대학 영동세브란스병원 흉부외과에서는 1998년 7월부터 1999년 2월까지 160예의 수부 다한증 환자에서 2mm 흉강경을 이용한 제2번 흉부 교감신경 절단술(T2 sympathicotomy) 80예와 제2번 흉부 교감신경 클립 차단술(T2 sympathetic block) 80예의 두 환자군을 대상으로 하였다. 평균수술 시간은 30분 이내 이었으며 평균입원기간은 1∼1.4일이었다. 평균 추적기간은 9∼9.6 개월(6~13개월)이었다. 제2번 흉부 교감신경 클립 차단술에서 클립의 불완전한 시술로 2명이 재수술을 받았고 1명은 심한 보상성 다한증으로 클립제거 수술을 받았으며, 수술 후 중증도의 재발은 8명에서 발생하였다. 안검 하수증이 12명에서 발생하여 2명이 안검 교정술을 받았으며 2명은 안검 교정술을 받을 예정이다. 3명은 증상이 완화되고 있는 상태로 추적관찰 중이다. 제2번 흉부 교감신경 절단술에서는 수술 후 수술부위에서 재발이 5명, 한 손의 재발은 3명이고, 보상성 다한증으로 인해 수술을 후회하는 경우는 6명이었다. 제2번 흉부 교감신경 절단술과 제2번 흉부 교감신경 클립 차단술의 결과에 따른 만족도에서 10점을 기준으로 각각 6.73과 7.07점으로 차이가 있으나 통계학적 유의한 차이는 없었다. 또한 보상성 다한증의 부위는 제2번 흉부 교감신경 절단술에서는 1.63개 부위, 제2번 흉부 교감신경 클립 차단술에서는 1.00개 부위로 차이가 있으나 통계학적 유의한 차이는 없었다. 수술 부위의 땀 안 나는 정도를 10점 기준으로 각각 8.73점과 8.20점으로 약간의 차이가 있으나 통계학적 유의한 차이는 없었다. 보상성 다한증으로 인한 불편함을 1에서 4까지 등급을 정하였을 때 클립차단술이 절단술보다 불편함이 낮게 통계학적 유의한 차이를 보였으며, 수술 후 나타난 보상성 다한증의 시기와 만족도와의 관계에서는 수술 후 5개월까지는 7.3점, 그 이후부터는 5.6점으로 통계학적 유의한 차이가 있었다(p<0.05) 제2번 흉부 교감신경 클립 차단술에서 보상성 다한증으로 생긴 환자의 불편을 수술 전 상태로 가역적 재수술에 의하여 회복시키려면 재수술의 시기(클립의 제거)를 2주에서 4주내에 결정해야 하는 어려움이 있으나, 가역적 재수술의 이점을 최대한 응용할 수 있다면 문제 해결의 새로운 수술로서 충분한 가치가 있다고 사료된다. 제2번 흉부 교감신경 클립 차단술에서 관찰된 15%의 안검 하수증의 주원인은 부적절한 위치선정보다는 새로운 시술의 적용단계에서 클립의 정확한 시술을 위해 발생된 초기의 박리와 신경견인을 생각할 수 있다. 제2번 흉부 교감신경 클립 차단술보다 제2번 흉부 교감신경 절단술 후 재발성 발한이 상대적으로 높은 것은 신경의 재성장과 밀접한 관계가 있다. 클립의 불완전한 시술의 보완으로 재발을 방지해야 할 것이며, 새로운 수술기법에서 신경견인으로 생길 수 있는 호너씨 증후군의 방지에 주의가 필요하다. 제2번 흉부 교감신경 절단술 후 재발된 환자에서 신경의 재성장의 기간은 보통 6개월부터 시작되는 것으로 고 찰되었고 앞으로 장기추적관찰이 필요하다고 판단된다. [영문] The thThe therapeutic rationale in the treatment of hyperhidrosis is the interruption of transmission of sympathetic impulses from the lower sympathetic ganglia through stellate ganglia to the hand such as thoracoscopic sympathectomy and sympathicotomy. However, due to its reversibility, the new approach of clipping of T2-sympathetic trunk without transection has been reported. This study was designed to examine patients satisfaction against this new approach. From July 1998 to February 1999, a total of 160 cases of the needle thoracoscopic thoracic sympathicotomy and thoracoscopic clipping of the T2 sympathetic chain were performed to minimize compensatory hyperhidrosis. The force of endoclip was adjusted to a degree that only the efferent nervous impulse was blocked or decreased without destroying the myeline sheath which is known to play an important role in nerve regeneration. This new method has lower incidence of compensatory hyperhidrosis after operation and has the advantage that the sympathetic tone of the hand could be recovered by the reverse procedure removing the clips. A linear analogue scale was used to assess the degree of sweating on the palms, face, and trunk (ranged from 1 to 10 where 1 is excessive sweating and 10 anhidrosis) as well as the patients satisfaction with the surgery (ranged from 1 regretted and 10 completely satisfied). Results showed that whereas the palmar sweat production and the patients satisfaction after sympathicotomy was 8.73 and 6.73, respectively, these parameters after clipping of the T2 sympathetic chain were similar, 8.20 and 7.07, respectively. There were 3 cases to be performed re-operation; in one case, the reversible operation(removal of clip) was performed due to severe compensatory hyperhidrosis; in two cases, one operation was failed to clip the right position and the other case, the clip was slipped out. Neither mortality nor life-threatening complications occurred in any case related to operations. Both operations showed a similar incidence to occur complications such as Horners syndrome. These results suggest that the endoscopic thoracic T2 sympathetic chain block using clipping be an equally efficient as compared with T2 sympathicotomy and have an advantage to reversibly adjust the results after surgery such as the reversible operation. Although these results are based on the preliminary study, it is recommended that the thoracic T2 sympathetic chain block by clipping is the better alternative for the treatment of hyperhidrosis.ope

폐암 세포주에 siRNA 기법을 이용한 cyclin A1과 cyclin B1의 세포살상 효과

Dept. of Medicine/박사[한글] 본 연구는 정상에서는 발현이 안되나 종양에서는 과 발현되는 종양생성인자에 중요한 cyclin A1과 cyclin B1을 폐암 세포주를 대상으로 siRNA기법으로 억제 시켜 초래되는 세포억제 혹은 세포살상효과를 판정한다.실험대상은 폐암세포주인 H157과 H596을 사용하며, HeLa 세포주와 정상 대조군으로 NIH3T3 세포주를 이용한다. 사용하는 기법은 RNA interference기법 중 siRNA방법을 이용하며 대상 물질인 cyclin A1 과 cyclin B1의 promotor하방 100bp이하 부위를 특이적으로 선택하여 oligofectamin으로 세포내 주입 후 dsRNA 생성한 후 RNA polymerase III에 의해 특이적 siRNA를 생성시키는 방법을 이용하였으며, 확인 및 검정방법은 관련 유전자들의 western blot, 면역형광검사, 유세포 측정기, Annexin V의 유세포 측정을 통한 apoptosis 측정, XTT 및 soft agar colony growth실험과 DNA ladder를 통한 apoptosis검사를 시행하였다.Cyclin B1을 대상으로 한 siRNA 결과 HeLa 세포주에서는 억제효과가 큰 반면 폐암 세포주에서는 세포 살상효과가 현저하지 않았다. 반면 Cyclin A1 siRNA는 폐암 세포주에서 세포 살상효과가 매우 현저하였으며, cyclin B1, cdc2, cdk2등의 관련 인자들의 억제효과도 동시에 관찰되었다. 세포고사도 각종 실험에서 모두 현저하게 나타났으며 bcl2 와 Bax 모두 변화가 있었다. 이는 p53의 변이형을 가진 세포주에서 나타난 결과이므로 이들 세포고사는 p53에 비의존적 경로로 나타난 것으로 해석된다.결론적으로, cyclin A1은 HeLa 세포주와는 달리 폐암 세포주에서 확연히 세포살상효과를 보여 매우 유망한 항암 효과를 가진 대상물질로 사료된다. [영문]Recent studies have shown that cyclin A1 and cyclin B1 are overexpressed in various tumor types but are present at low levels in normal tissues, and that cyclin A1 is restricted to germ cells undergoing meiosis. In order to explore the possibility of employing cyclin A1 and cyclin B1 as an anticancer target, we knocked down cyclin A1 and cyclin B1 in the lung cancer cell lines, H157 and H596, and in HeLa cells using RNA interference (RNAi). Subsequently, we monitored cell cycle-related molecules by Western blot and immunofluorescence and determined cell cycle distribution by flow cytometry. XTT, Annexin V, DNA ladder and soft agar colony growth experiments were performed to detect cell viability and proliferation. Furthermore, we analyzed cell apoptosis by measuring Bcl-2 and Bax protein levels and by the DNA ladder assay.After treatment with cyclin B1 siRNA, cyclin B1 was found to be drastically downregulated, whereas cyclin A, CDK2 and Cdc2 were almost unaffected in H157 and H596. Following cyclin A1 siRNA, cyclin B1, Cdc2 and CDK2 were all drastically downregualted; the S phase fraction increased significantly; and targeted cell viability and cell colony forming ability were markedly diminished. Bcl-2 was noticeably attenuated, but Bax hardly changed. Cultured cells displayed typical DNA ladders. The loss of cyclin A1 resulted in the downregulation of cyclin B1, Cdc2 and CDK2, S phase delay eventual cell apoptosis, and a decrease in cell viability and proliferation. Cyclin B1 was weakly expressed in lung cancer cell lines (data not shown), thus the effect of cyclin B1 siRNA had little effect on them. Our studies suggest that cyclin A1 may be a promising anticancer target specific to lung cancer.ope