Accounting for variability in the detection and use of markers for simple and complex traits

There are many sources of variability in gene–phenotype associations. During the measurement of genotype and phenotype and during selection, researchers must deal with experimental error in trials; gene-gene interaction (epistasis) for sub-traits and observed traits; trait-trait interaction (pleiotropy) and gene- or genotype-by-environment interaction. These effects can be structured in a framework that allows simulation of the entire gene-environment ‘landscape’. Studies of these landscapes have been published by others. Here we aim to explain with simple examples some of the types of insights that can be made. A current challenge for breeders working with simple marker–phenotype associations is to design selection strategies that can rapidly create new combinations of multiple marker-based traits. For a real-world example in wheat, we have used simulation to show how gene enrichment during early generations (selection of homozygotes and heterozygotes with desirable alleles) can greatly reduce resource requirements when combining 9 genes into one genotype through marker-assisted selection. Another wheat example compares phenotypic and QTL-based selection for coleoptile length where the QTL also had a pleiotropic association with plant height. These simulations show the relative negative effects of either low heritability, or less than complete detection of QTL associated with traits. Finally, we revisit a marker-assisted selection (MAS) example whereby a QTL study is undertaken on a population for a complex trait, and then those QTL are used in selection. This process is subject to all sources of error described above. If the trait is complex, then interactions among sub-traits; between sub-traits and the environment; or between the chromosomal locations of controlling genes, create an extremely ‘rugged’ selection landscape that slows breeding progress. In this situation, a detailed understanding of some of these interactions is required if MAS is to be able to exceed the progress of conventional breedin

Designing crossing and selection strategies to combine diagnostic markers and quantitative traits

Tese de doutoramento em Biociências, ramo de especialização em Toxicologia, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraDoxorubicin (DOX) is one of the most potent antineoplastic drugs. Although possessing a superior anti-­‐‑cancer activity, a broader clinical use of DOX is limited by a dose-­‐‑dependent, constant and cumulative cardiomyopathy involving deterioration of mitochondrial function. Although acute effects of DOX treatment often disappear when treatment finishes, chronic effects often result in a persistent cardiotoxicity, including a progressive deterioration of mitochondrial metabolism, the development of cardiomyopathy and ultimately congestive heart failure. Important in the context of DOX-­‐‑induced cardiotoxicity, mitochondrial disruption has been observed in different models. This alteration of mitochondrial function is often sub-­‐‑clinical and is only manifested as cardiomyopathy when other factors are combined, including age or different types of cardiovascular stress. Also, metabolic alterations in the cardiac cell occur, which contribute to the ability of the heart to withstand increased workloads. Although mitochondrial disruption is an early and sensitive marker of DOX cardiotoxicity, how metabolic stress contributes to the development of cardiomyopathy remains to be determined. Because of this gap in knowledge, the objective of this work was to use of model of metabolic inhibition in perfused hearts from saline (SAL) and DOX-­‐‑ treated rats in order to identify metabolic alterations caused by an acute and sub-­‐‑ chronic treatment. Our assumption for this strategy is that a lower susceptibility to a determined inhibitor during perfusion, would be a sign of a more robust (i.e. more capacity) of the targeted pathway(s). XV For the acute treatment protocol, sixteen week-­‐‑old male Wistar rats were i.p. injected with 20mg/Kg DOX or 1mg/Kg 0.9%NaCl and sacrificed 24 hours later. For sub-­‐‑ chronic protocol, eight weeks-­‐‑old male Wistar rats received seven weekly s.c. injections with DOX(2mg/Kg) or equivalent SAL solution and sacrificed one week after the last injection. Following the protocol treatments, animals were sacrificed and hearts were removed and perfused using a Langendorff apparatus with distinct cardiac substrates (glucose, galactose plus glutamine -­‐‑ GG or octanoate plus malate – OM). Glycolytic (iodoacetate) and oxidative phosphorylation (rotenone-­‐‑ Rot or cyanide-­‐‑ KCN) inhibitors were separately added to the different metabolic perfusates, aiming to detect undercover mitochondrial defects in the DOX-­‐‑treated group. In non-­‐‑perfused hearts, or hearts perfused in the absence (time controls, TC) or presence of inhibitors, selected metabolic and mitochondrial proteins were semi-­‐‑ quantified by Western blotting, and mRNA levels were quantified by RT-­‐‑PCR. In the acute DOX treatment model, hearts perfused with glucose as substrate suffered a decline in the number of heart beat and rate pressure product (RPP) when iodoacetate was added, contrarily to Rot or KCN which had no effect. With GG, inhibitor titration decreased the heart rate, despite that the decrease in the RPP was more evident in SAL vs. DOX group with iodoacetate and KCN. Perfusion with OM resulted in decreased heart rate an RPP in the presence of the inhibitors, showing equal response between treatments. When glycolytic and mitochondrial proteins were semi-­‐‑quantified by Western blotting, alterations in proteins involved in mitochondrial biogenesis and autophagy were observed in DOX hearts perfused with inhibitors. The data from the acute protocol study, appears to suggest that hearts from DOX-­‐‑treated animals have improved function in the presence of XVI metabolic inhibitors, thus indicating that DOX triggers adaptations that allow the hearts to be less susceptible to mitochondrial and glycolytic inhibition. In the sub-­‐‑chronic model and using glucose as substrate, the DOX-­‐‑treated group showed again a better tolerability to inhibitors than SAL. With GG, titration with iodoacetate caused a decrease in heart beat and on RPP in DOX group, when rot or KCN was added the number of heart beat and RPP remains identical between the two groups. Glycolytic and mitochondrial proteins semi-­‐‑quantification suggested an impairment of autophagy in DOX perfused hearts perfused, more evident during GG perfusion. The presence of inhibitors in the perfusion also generally decreased the total amount of proteins detected by Western Blotting, although glycolytic proteins were increased when hearts were perfused with glucose, contrarily to GG perfusion. The results suggest that sub-­‐‑chronic DOX-­‐‑treated rats suffered a metabolic remodeling which is based on stronger glycolytic fluxes to maintain contractility, although no overt mitochondrial defect was uncovered. A surprising result is that regardless of the perfusion buffer used, no striking differences between SAL and DOX hearts in terms of hemodynamic parameters were found. The present work suggests that metabolic remodeling during DOX acute and sub-­‐‑ chronic treatment maintains cardiac function in the treated animals. This remodeling is apparently based in a stronger contribution of glycolysis to overall metabolism. Data from protein amount analyzed suggest that DOX treatment in both models affect important regulators of autophagy, mitochondrial biogenesis as well as the adenine nucleotide translocator. The results also suggest that a longer treatment XVII protocol or resting period should also be tested in order to uncover more profound differences.A doxorrubicina (DOX) é um dos fármacos antineoplásicos mais potentes. Apesar de possuir uma actividade anti-­‐‑cancro superior, uma mais ampla utilização clínica da DOX é limitada por uma dose-­‐‑dependente, constante e cumulativa cardiomiopatia que envolve a deterioração da função mitocondrial. Embora os efeitos agudos do tratamento DOX normalmente desaparece quando se conclui o tratamento, os efeitos crónicos resultam muitas vezes numa cardiotoxicidade persistente, incluindo a deterioração progressiva do metabolismo mitocondrial, o desenvolvimento de cardiomiopatia e por fim insuficiência cardíaca congestiva. Importante no contexto da cardiotoxicidade induzida pela DOX, perturbação mitocondrial foi observada em diferentes modelos. Esta alteração da função mitocondrial é muitas vezes sub-­‐‑clínica e só se manifesta como cardiomiopatia quando outros factores são combinados, incluindo a idade ou diferentes tipos de estresse cardiovascular. Além disso, ocorrem alterações metabólicas na célula cardíaca, o que contribui para a capacidade do coração resistir a maior demanda. Embora a perturbação mitocondrial seja um marcador precoce e sensível de DOX cardiotoxicidade, como o stress metabólico contribui para o desenvolvimento de cardiomiopatia permanece por determinar. Devido a essa lacuna no conhecimento, o objetivo deste trabalho foi a utilização de um modelo de inibição metabólica em corações perfundidos de ratos tratados com uma solução salina (SAL) e ratos tratados com DOX, a fim de identificar alterações metabólicas causadas por um tratamento agudo e sub-­‐‑crônico. XIX O nosso pressuposto para esta estratégia é que uma menor susceptibilidade a um determinado inibidor durante a perfusão, seria um sinal de uma forma mais robusta (ou seja, mais de capacidade) da via-­‐‑alvo (s). Para o protocolo de tratamento agudo, ratos machos Wistar de 16 semanas de idade foram injectados i.p. com 20 mg / kg de DOX ou de 1 mg / kg a 0,9% de NaCl e sacrificados 24 horas mais tarde. Para o protocolo sub-­‐‑crônico, ratos machos Wistar de oito semanas de idade, receberam sete injecções s.c. semanais com DOX (2 mg / kg) ou uma equivalente da solução SAL sendo sacrificados uma semana após a última injecção. Após o protocolo de tratamentos, os animais foram sacrificados e os corações foram perfundidos com um aparelho de Langendorff com substratos cardíacos distintos (glucose, galactose mais glutamina -­‐‑ GG ou octanoato mais malato -­‐‑ OM). Inibidores glicolíticos (iodoacetato) e inibidores da fosforilação oxidativa (Rot-­‐‑ rotenona ou KCN-­‐‑ cianeto) foram adicionados separadamente nos diferentes substratos metabólicos, com o objetivo de detectar defeitos mitocondriais no grupo tratado com DOX. Em corações não perfundidos, ou corações perfundidos na ausência (controlos de tempo, TC) ou na presença de inibidores, algumas proteínas metabólicas e proteínas mitocondriais foram semi-­‐‑quantificadas por Western blotting, e os níveis de mRNA foram quantificados por RT-­‐‑PCR. No modelo de tratamento agudo DOX, corações perfundidos com glucose como substrato sofreram um declínio no número de batimentos cardíacos e produto da taxa de pressão (RPP), quando iodoacetato foi adicionado, ao contrário da Rot ou KCN, que não teve nenhum efeito. Com GG, a titulação com o inibidor diminuiu a frequência cardíaca, apesar de que a diminuição da RPP foi mais evidente no grupo SAL vs. DOX com iodoacetato e KCN. Perfusão com OM resultou em diminuição da XX frequência cardíaca e do RPP na presença dos inibidores, mostrando uma resposta igual entre os tratamentos. Quando proteínas glicolíticas e mitocondriais foram semi-­‐‑ quantificadas por Western blotting, alterações de proteínas envolvidas na biogênese mitocondrial e autofagia foram observados em corações DOX perfundidos com inibidores. Os dados do protocolo de estudo agudo, parecem sugerir que os corações provenientes de animais tratados com DOX na presença de inibidores, têm a função metabólica melhorada, indicando assim que a DOX desencadeia adaptações que permitem que os corações sejam menos susceptíveis à inibição mitocondrial e glicolítica. No modelo sub-­‐‑crónica e utilizando glucose como substrato, o grupo tratado com DOX mostrou novamente um melhor tolerabilidade para inibidores que SAL. Com GG, a titulação com iodoacetato causou uma diminuição no batimento cardíaco e no RPP em grupo DOX, quando rot ou KCN foi adicionado o número de batimentos cardíacos e RPP permaneceram idênticos entre os dois grupos. A semi-­‐‑quantificação de proteínas glicolíticas e mitocondriais sugerem uma deficiência da autofagia em corações DOX perfundidos, mais evidente durante a perfusão com GG. A presença de inibidores da perfusão geralmente também reduziu a quantidade total de proteínas detectadas através de Western Blot, embora proteínas glicolíticas aumentaram quando os corações foram perfundidos com glucose, ao contrário da perfusão com GG. Os resultados sugerem que ratos tratados sub-­‐‑cronicamente com DOX sofreram uma remodelação metabólica, que é baseado em fluxos glicolíticos mais fortes para manter a contratilidade, embora nenhum defeito mitocondrial ostensivo foi descoberto. XXI Um resultado surpreendente é que, independentemente do tampão de perfusão utilizado, não foram encontradas diferenças marcantes entre SAL e DOX corações em termos de parâmetros hemodinâmicos. O presente trabalho sugere que o remodelação metabólica durante o tratamento agudo e sub-­‐‑crônico com DOX, mantém a função cardíaca nos animais tratados. Esta remodelação é, aparentemente, baseado numa contribuição mais forte da glicólise ao metabolismo geral. Os resultados de quantidade de proteína analisados sugerem que o tratamento com DOX em ambos os modelos afectam importantes reguladores da autofagia e biogénese mitocondrial, bem como o translocador de nucleótidos de adenina. Os resultados também sugerem que um protocolo de tratamento mais longo ou com um período de repouso também devem ser testados a fim de descobrir diferenças mais profundas

Genetic analysis of leaf rolling in wheat

Dissertação de mestrado em Química Farmacêutica Industrial, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraAtualmente, as doenças neurodegenerativas como a isquemia cerebral, Alzheimer e Parkinson atacam em massa a população mundial. O acréscimo destas patologias crê-se estar relacionado com falhas na homeostase de zinco e de espécies reativas de oxigénio (ROS) no sistema nervoso central. Neste trabalho questões desta natureza foram investigadas nas sinapses das fibras musgosas da área CA3 do hipocampo de rato. Os estudos foram efetuados em fatias cerebrais utilizando sondas fluorescentes de zinco e de espécies reativas de oxigénio. Sinais intracelulares de zinco foram medidos utilizando o indicador Newport Green na forma permeante, que não complexa o zinco presente nas vesículas sinápticas e que é co-libertado com o glutamato. As variações de zinco foram induzidas por meio de despolarizações com KCl ou usando um meio extracelular com TEA e rico em cálcio. No primeiro caso verificou-se um aumento significativo dos sinais de fluorescência de zinco. Os resultados obtidos usando antagonistas de recetores de glutamato e um bloqueador de canais de cálcio dependentes do potencial, indicam que aqueles sinais têm origem na zona pós-sináptica. No meio com TEA e muito cálcio, usado para induzir quimicamente a potenciação de longa duração, que se considera representar uma forma de memorização ao nível celular, verificou-se uma diminuição reversível da intensidade de fluorescência. Este facto pode ser devido à activação, pelo zinco libertado, de canais de K/ATP pré-sinápticos, o que origina a hiperpolarização da membrana e uma diminuição na libertação de zinco. Alterações na formação de espécies reativas de oxigénio foram estudadas, por meio da sonda H2DCFDA permeante, que é sensível essencialmente aos radicais hidroxilo e peróxido de hidrogénio. Os resultados obtidos, induzidos de forma semelhante aos de zinco, têm dum modo geral um comportamento idêntico ao destes sinais Inúmeros avanços na indústria e na medicina prometem melhorias ao nível das patologias anteriormente mencionadas e outras. No entanto, existe o reverso da moeda, o aumento da industrialização e de fármacos disponíveis provoca um aumento da poluição em efluentes e águas residuais, tendo em conta que os processos usados nas estações de tratamento não são totalmente eficazes. III O sulfametoxazole (SMX) é um antibiótico largamente utilizado, que não é totalmente metabolizado pelo organismo, tendo por isso vindo a ser detetado em águas residuais. Os sinais de zinco medidos aumentam quando as fatias são expostas a esta sulfonamida, voltando ao nível inicial após a mudança para o meio extracelular normal. O efeito do sulfametoxazole nas espécies reativas de oxigénio também foi testado, tendo-se verificado um aumento daquelas espécies na presença de SMX. Os resultados mostram que a ação deste antibiótico não é reversível, por este motivo, as quantidades ambientais de SMX nas águas residuais assumem uma preocupação crescente. A observação de efeitos irreversíveis na formação de espécies reactivas de oxigénio durante actividade neuronal intensa, sugere que aquele fármaco pode contribuir para diversas patologias neurodegenerativas.Currently, neurodegenerative diseases such as cerebral ischemia, Alzheimer's and Parkinson's mass attack the world population. The increase of these diseases is believed to be related to failures in the homeostasis of zinc and of reactive oxygen species in the central nervous system. In this work such issues have been investigated in the mossy fiber synapses from area CA3 of the rat hippocampus. The studies were performed in brain slices using fluorescent probes of zinc and of reactive oxygen species. Intracellular zinc signals were measured using the indicator Newport Green in the permeant form, that does not complex the zinc present in the synaptic vesicles which is co-released with glutamate. The zinc changes were induced by KCl depolarization or applying an extracellular medium containing TEA and rich in calcium. In the first case a significant increase of the fluorescence zinc signals was observed. The results obtained using antagonists of glutamate receptors and one blocker of voltage-dependent calcium channels, indicate that those signals have a postsynaptic origin. In the medium containing TEA and high calcium, used to chemically induce long-term potentiation, which is considered to represent a way of memory formation at the cellular level, a reversible decrease of the fluorescence intensity was observed. This fact may be due to the activation, by released zinc, of presynaptic K / ATP channels, which leads to membrane hyperpolarization and to a decrease in zinc release. Changes in the formation of reactive oxygen species were studied by means of the permeant H2DCFDA probe, which is specially sensitive to the hydroxyl and hydrogen peroxide radicals. The results, induced in a similar way as for zinc, have in general an identical behaviour to that of these signals. Numerous advances in industry and medicine promise improvements in the above mentioned pathologies and others. However, there is the reverse of the coin, the increasing industrialization and availability of drugs results in increased pollution in waste waters and effluents, since the processes used in water treatment plants are not entirely effective. V Sulfamethoxazole (SMX) is a widely used antibiotic, which is not fully metabolized by the organism and, for this reason, is being detected in wastewaters. The measured zinc signals increase when the slices are exposed to this sulfonamide, returning to the initial level after changing to the normal extracellular medium. The effect of sulfamethoxazole in reactive oxygen species was also tested, having been observed an increase of those species in the presence of SMX. The results show that the action of this antibiotic is not reversible, therefore, their environmental quantities in wastewaters are of growing concern. The observation of irreversible effects on the formation of reactive oxygen species during intense neuronal activity, suggests that that pharmaceutical agent may contribute to various neurodegenerative pathologie

Phenotypic evaluation and genetic analysis of seedling emergence in a global collection of wheat genotypes (Triticum aestivum L.) under limited water availability

The challenge in establishing an early-sown wheat crop in southern Australia is the need for consistently high seedling emergence when sowing deep in subsoil moisture (>10 cm) or into dry top-soil (4 cm). However, the latter is strongly reliant on a minimum soil water availability to ensure successful seedling emergence. This study aimed to: (1) evaluate 233 Australian and selected international wheat genotypes for consistently high seedling emergence under limited soil water availability when sown in 4 cm of top-soil in field and glasshouse (GH) studies; (2) ascertain genetic loci associated with phenotypic variation using a genome-wide association study (GWAS); and (3) compare across loci for traits controlling coleoptile characteristics, germination, dormancy, and pre-harvest sprouting. Despite significant (P 85%) across nine environments. Moreover, 21 environment-specific quantitative trait loci (QTL) were detected in GWAS analysis on chromosomes 1B, 1D, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5B, 5D, and 7D, indicating complex genetic inheritance controlling seedling emergence. We aligned QTL for known traits and individual genes onto the reference genome of wheat and identified 16 QTL for seedling emergence in linkage disequilibrium with coleoptile length, width, and cross-sectional area, pre-harvest sprouting and dormancy, germination, seed longevity, and anthocyanin development. Therefore, it appears that seedling emergence is controlled by multifaceted networks of interrelated genes and traits regulated by different environmental cues