El aceite de oliva virgen: ese gran desconocido

Virgin olive oil is the juice of Olea europea fruit prepared from 358 olive cultivar grooves. Its preparation generates several chemical imperfections. Extra virgin olive oil is the only able to provide the consumer the whole panoply of biological propertiesEl aceite de oliva virgen es el zumo del fruto de la Olea europea procedente de más de 358 de variedades de olivos. Su obtención genera diversas impurezas químicas. Solo el aceite de oliva virgen extra es el único capaz de garantizar al consumidor la integridad de sus características biológicas

Mecanismos moleculares de la esteatosis hepática no alcohóica en diversos modelos animales e influencia de terpenos del aceite de oliva

Las sociedades occidentales están haciendo frente a nuevas enfermedades fruto de la descoordinación entre los cambios en nuestros hábitos alimenticios y nuestra capacidad de adaptación a los mismos. Una de estas enfermedades es la esteatosis hepática, caracterizada por el depósito de gotas lipídicas en el hígado. Esta puede comprometer la calidad de vida de las personas hasta progresar a hepatocarcinoma. Para poder combatir esta enfermedad es necesario el desarrollo de métodos diagnósticos precoces y tratamientos para evitar o ralentizar el progreso de esta enfermedad. Para alcanzar ambos objetivos la caracterización de las bases moleculares de la esteatosis es fundamental.Entre los muchos genes que intervienen en el desarrollo de la esteatosis hepática, Cidec ocupa un puesto especial ya que participa en la fusión de las gotas lipídicas y el conocimiento sobre factores que regulan su expresión resulta clave. En el presente trabajo se explora la influencia de distintos componentes dietéticos, observando que el colesterol estimula su expresión. Asimismo, también se observa un dimorfismo sexual en el desarrollo de la esteatosis en el que parece que la expresión de Cidec regulada por las hormonas femeninas a través del cofactor de la transcripción Pgc1a juega un papel clave.Para ahondar en el conocimiento de los mecanismos moleculares de la esteatosis hemos desarrollado y caracterizado un modelo esteatósico de rápido desarrollo con cerdos procedentes del cruce de razas comerciales. Gracias a este modelo, y mediante el uso de las transcriptómica y proteómica dirigida hemos logrado identificar nuevos genes que responden tanto al desarrollo como a la regresión de esta patología. Además, también nos ha ofrecido nuevos candidatos a marcadores plasmáticos de la esteatosis hepática: LGALS3 e ISG15.A la hora de buscar tratamientos, el uso de nutrifarmacos o alimentos funcionales resultan un enfoque muy práctico y atractivo para la sociedad. En este aspecto la incorporación de escualeno en la dieta ha mostrado ser eficaz para reducir el porcentaje de gotas lipídicas hepáticas tanto en ratones como enconejos. Por ello en este trabajo hemos explorado el efecto a corto plazo de la suplementación de escualeno al 0,5% en cerdos previamente esteatósicos. A través de dicho experimento hemos observado que el escualeno reproduce sus efectos en este modelo modificando tanto el lipidoma hepático como el plasmático.La complejidad que entraña la esteatosis hepática tanto en su desarrollo como en su regresión va más allá de la mera acumulación de grasa e implica cambios en todo tipo de biomoléculas a través de la regulación de distintas rutas metabólicas en función de los componentes de la dieta. En este marco el escualeno es capaz de paliar la esteatosis hepática en distintos modelos. Por ello su futuro uso como como alimento funcional puede ser una clave en el tratamiento de la esteatosis hepática.<br /

Generación y caracterización metabólica del ratón carente de la proteína 5 con dominios tiorredoxina (TXNDC5) y su interacción con el escualeno

Actualmente, las herramientas ómicas tienen una potencia sin precedentes, permitiendo encontrar dianas moleculares cuyas funciones no habían sido previamente descritas. Previamente, nuestro grupo describió como la presencia del escualeno en dieta tenía propiedades anti ateroescleróticas y anti esteatósicas. Usando herramientas proteómicas, se encontró la proteína 5 con dominios tiorredoxina (TXNDC5) modulada por el escualeno y asociada con el contenido de grasa hepática. TXNDC5 es una proteína disulfuro isomerasa, encargada de regular el correcto plegamiento de proteínas, actuando como chaperona en el retículo. Sin embargo, las funciones de TXNDC5 y en especial su papel metabólico en el hígado están poco definidas. Esclarecer las funciones de una proteína con potencialmente muchas implicaciones es un proceso fundamental para la ciencia básica, especialmente si pudiera estar implicada en la prevención de enfermedades cardiovasculares o esteatosis.En el presente trabajo, utilizando las nuevas herramientas de edición genética CRISPR/cas9 se generó un modelo animal carente de TXNDC5, y una línea celular hepática que replicase el modelo animal. Para ahondar en el conocimiento de la implicación de TXNDC5, se realizaron varias intervenciones dietéticas. Bajo una dieta occidental se encontró en machos un hígado con un contenido más graso en la ausencia de TXNDC5, por ello se decidió estudiar su transcriptoma, encontrándose una mayor expresión de los genes de fase aguda, amiloide sérico 1 y 2 (Saa1 y Saa2) en ausencia de la tiorredoxina. Debido a la previa implicación en aterosclerosis, se estudió la influencia de TXNDC5 en el perfil plasmático, encontrándose una mayor cantidad de amiloide sérico, APOA1 y actividad PAF-AH, sin embargo, también se encontraron mayores niveles de peroxidación lipídica. La caracterización lipoproteica no reveló diferencias en su perfil, localizándose el amiloide principalmente en las partículas de alta densidad nacientes, curiosamente menos oxidadas en ausencia de TXNDC5. Este hecho ofrece un nuevo punto de vista en la influencia del amiloide, previamente descrito como un marcador aterosclerótico. Aunque se había descrito una posible función de TXNDC5 en el plegamiento de la insulina, los experimentos in vivo de este trabajo resumen una menor glicemia acompañada de un aumento de los ácidos grasos no esterificados en plasma. Se realizó una caracterización metabólica en la que no se observó implicación en la gluconeogénesis, pero una mayor sensibilidad a la insulina en ausencia de TXNDC5. Bajo una dieta más agresiva, se observó un resultado similar: una mayor tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina, una menor glicemia acompañada de los mayores niveles de ácidos grasos no esterificados y unos sorprendentes mayores niveles de insulina en plasma. Por último, la ausencia de TXNDC5 impide la acumulación de escualeno en el hígado murino, verificando la implicación previamente observada. Este hecho se reprodujo en las gotas lipídicas, orgánulo propuesto para su acumulación, por lo que se realizó una caracterización del proteoma del orgánulo. Se observó no solo la implicación de TXNDC5 sino como el cambió de un único componente en la dieta es capaz de modular su proteoma. Se encontraron varias proteínas moduladas por el escualeno, como TXNDC5, siendo CALR y APMAP influidas también por la tiorredoxina, pudiendo estar implicadas en el mecanismo de acumulación.Todos estos resultados que se describen en este trabajo, unidos al hecho de que solamente se encontraron cambios en machos, dimorfismo sexual similar al experimento inicial, confirman la gran complejidad de TXNDC5 en su función y en los mecanismos moleculares en los que intervienen como se detalla el este trabajo. <br /

Transcriptómica de la esteatosis hepática no alcohólica inducida en cerdos a través de la dieta

Este Trabajo Final de Grado parte de las muestras de un estudio que se realizó utilizando cerdos a los que se les alimentó con una dieta enriquecida en grasa saturada, colesterol, fructosa y ácido cólico. A los 2 meses de la intervención dietética desarrollaron hígado graso. Se han analizado los RNAs hepáticos antes de la intervención y a los 2 meses de esta para ver qué cambios a nivel del transcriptoma están implicados en el desarrollo de la NAFLD en este modelo animal análogo al humano.Se han procesado las muestras para extraer su RNA, estos sirvieron para para analizar los transcriptomas mediante RNAseq. Los resultados de los 3 pooles de muestras, fueron analizados para ver el patrón de genes implicados. Aquellos genes con cambios de expresión más relevantes se confirmaron individualmente por RT-qPCR y se analizaron sus expresiones antes y después de la intervención dietética, para ver las diferencias debidas a la acumulación de grasa en el hígado (esteatosis hepática). Se estudió mediante inmunohistoquímica la cantidad de la proteína inflamatoria CD68 en las muestras de inicio o control y en las muestras de tratamiento o esteatosis. Se analizaron una serie de parámetros bioquímicos séricos implicados en el desarrollo de esta patología.Los animales desarrollaron NAFLD en tras 2 meses de intervención dietética confirmándose con la histología hepática. Además, se confirmó inflamación mediante la detección inmunohistoquímica de la proteína CD68 propia de los macrófagos. Los genes MT1D, GPNMB, SQLE, ENTPPL, LOC100520753, LOC102166944, MOXD1, NANOS1, PEPB4, SLC51B y LGAL S3 mostraron cambios estadísticamente significativos tras la intervención dietética tanto en el RNAseq como en la RTqPCR. Los cuerpos cetónicos junto con la fosfatasa alcalina podrían convertirse en posibles nuevos biomarcadores para el diagnóstico precoz de esta enfermedad metabólica.<br /

TXNDC5, una nueva puerta abierta en investigación biomédica

TXNDC5, denominada en inglés Thioredoxin Domain containing 5, proteína5 con varios dominios tiorredoxina (TXNDC5), se localiza preferentemente enel retículo endoplasmático (RE) aunque es posible observarla en lisosomas,vacuolas, citosol, aparato de Golgi, mitocondrias, membrana plasmática eincluso en el medio extracelular. Posee actividad disulfuro isomerasa,favorecida por las condiciones redox en el RE, y actividad chaperona. Sepresenta en múltiples aparatos y sistemas, destaca su implicación enpatología tumoral observándose en cáncer de próstata, riñón, estómago,esófago, colon, hígado, laringe, pulmón, cuello uterino y músculo estriado,dando a conocer tras su estudio individualizado posibles dianas terapéuticaspara el control de la enfermedad. En lo que se refiere a patología no tumoral,hasta ahora se conocía su participación en enfermedades autoinmunes comola artritis reumatoide y endocrinológicas como la diabetes mellitus. Sinembargo, tras concluir el presente trabajo, se revela también su papel enpatologías cardiacas, como la fibrosis miocárdica y obstétricas, como lapreeclamsia en mujeres embarazadas, a la espera de su posible repercusiónen otras enfermedades en un futuro.<br /

Caracterización de las gotas lipídicas en modelos esteatósicos de ratones carentes de ApoE

Las gotas lipídicas son consideradas orgánulos celulares dinámicos y ubicuos. Se componen de un núcleo central de lípidos neutros, fundamentalmente triglicéridos y ésteres de esteroles cubiertos por una monocapa de fosfolípidos y proteínas estrechamente relacionadas con la biosíntesis, metabolismo, tráfico e interacción de las gotas lipídicas con el resto de orgánulos celulares. Presentan un papel central en la homeostasis energética celular, así como en el almacenamiento lipídico y renovación de las distintas membranas celulares. El estudio se centra en las gotitas de lípidos del hígado debido a que su acumulación anormal en este órgano conduce al desarrollo de esteatosis hepática inducida por una dieta Western, como resultado final de enfermedades metabólicas muy prevalentes actualmente como síndrome metabólico, obesidad o aterosclerosis. La esteatosis no alcohólica relacionada con la obesidad se conoce como NAFLD. En este trabajo experimental se han aislado las gotitas lipídicas de hígado graso de ratones carentes de Apoe mediante separación por ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. De este modo, se obtienen las gotas lipídicas en fracciones de distintos tamaños y se caracterizan las proteínas asociadas y expresadas diferencialmente entre sexos mediante proteómica e inmunodetección por Western Blot a nivel de fracción de gota lipídica total y en función de su tamaño.Palabras clave: gotas lipídicas, hígado, esteatosis hepática, ultracentrifugación, proteínas, proteómica, Western Blot.<br /

Caracterización del estrés oxidativo en función del tipo de proteína dietética en ratones carentes de apoE

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica de etiología multifactorial, que constituye el mecanismo fisiopatológico subyacente de las enfermedades cardiovasculares. Al ser una de las principales causas de muerte en el primer mundo, es fundamental el desarrollo de estudios epidemiológicos para el análisis de factores de riesgo y prevención. No obstante, el desarrollo de esta patología es complejo y lento en el ser humano, de forma que se utiliza el ratón carente de la apolipoproteína E como modelo experimental. Este animal desarrolla una aterosclerosis espontánea al impedirse el aclaramiento hepático de quilomicrones remanentes, siendo un modelo animal fundamental para el estudio del efecto de las dietas sobre el metabolismo lipídico.En este proyecto, ratones ApoE KO machos y hembras fueron alimentados con cuatro dietas que diferían únicamente en la fuente proteica. Se evaluó la influencia de la caseína y de las proteínas de soja, pollo y pavo sobre la lipemia y estatus oxidativo en plasma sanguíneo. Para ello, los distintos grupos de animales se sometieron a determinaciones de colesterol plasmático y de actividad paraoxonasa. Las lipoproteínas plasmáticas fueron separadas por cromatografía para estimar su estado oxidativo y evaluar la capacidad protectora de las HDL sobre las LDL. En los resultados se observó que las LDL de estos ratones no estaban muy oxidadas, lo que impidió ver el efecto protector de las HDL, a excepción del grupo de soja. Se le atribuye un efecto antiaterogénico a la proteína de pavo en ambos sexos, ya que implica niveles más bajos de colesterol plasmático y mayor actividad paraoxonasa 1 en suero, que actúa como antioxidante. <br /

Influencia del método de extracción del aceite de oliva virgen extra en el perfil lipídico y el estado oxidativo en ratones ApoE.

El aceite de oliva virgen extra es un componente fundamental de la dieta mediterránea. Se considera un alimento funcional debido a sus efectos positivos sobre la salud de los consumidores. Entre estos beneficios destacan su capacidad para mejorar la respuesta frente al estrés oxidativo, un efecto antihiperlipémico que genera un efecto protector a nivel cardiovascular y una actividad anticancerígena.En este trabajo se va a estudiar la influencia del método de extracción del aceite de oliva virgen extra sobre el perfil lipídico y el estado oxidativo en ratones carentes de ApoE. La técnica experimental estudiada denominada PEF (de sus siglas en inglés, Pulsed Electric Field) consiste en aplicar una corriente (con pulsos de alto voltaje) durante un rango de microsegundos a través de la pasta de la oliva para la extracción del aceite. Se analizó el perfil lipídico y lipoproteico de un grupo de 61 ratones carentes de ApoE de los cuales había 28 machos y 33 hembras, divididos en dos grupos en base al tipo de método empleado para la extracción del aceite. Tras 12 semanas de dieta, se llevó a cabo el análisis de parámetros plasmáticos relacionados con la aterosclerosis (triglicéridos, glucosa, colesterol total y ácidos grasos no esterificados), el estudio de sus perfiles lipídicos (colesterol total, colesterol no esterificado y esterificado) y se midió el estrés oxidativo (PON1, ApoA1…). Se concluyó que la ingesta de la dieta con aceite de pulsos no conlleva a cambios significativos con respecto a la dieta control en los parámetros plasmáticos de machos. Sin embargo, esta dieta de pulsos indujo a una disminución significativa del colesterol plasmático en hembras. Además, el estado oxidativo de las lipoproteínas plasmáticas es menor en los animales alimentados con el aceite extraído por PEF, aunque no se observe un efecto protector por parte de las HDL.<br /

Clonaje y expresión de Syt1 en ratones y cultivo celular

Resumen Introducción: La sinaptotagmina1 es una proteína integral de membrana de las vesículas sinápticas encontrada en el sistema nervioso sobre la cual se ha investigado otras posibles funciones en distintos órganos y sistemas así como su implicación en distintos modelos de enfermedad a nivel neurológico y en la actualidad, en la esteatosis hepática. Material, métodos: El gen hepático murino Syt1 fue clonado en un plásmido que contenía un promotor específico de hepatocito, un gen reportero de luciferasa y un gen de resistencia a la kanamicina (pLIVE.luc) para la selección bacteriana utilizando el In-Fusion® HD Cloning kit de TakaraBio USA. Tras ello, la presencia y función de Syt1 se verificó con diferentes métodos incluyendo cultivo celular y experimentación animal. Resultados y Discusión: Se ha clonado con éxito Syt1 y la transfección demuestra expresión en los controles y sobreexpresión en los casos demostrando la expresión normal hepática de Syt1 y la sobreexpresión exitosa. Conclusiones: El diseño del plásmido es satisfactorio, la luciferasa es un buen marcador del funcionamiento del plásmido previo a recolección del ARNm y el promotor pLIVE demuestra ser realmente específico de tejido hepático. Abstract Introduction: The synaptotagmine 1 is a synaptic vesicle integral membrane protein found in the nervous system which functions has been researched in other tissues and systems as well as its possible implications in neurological diseases and currently in hepatic steatosis. Material, methods: murine hepatic Syt1 was cloned in a plasmid containing a hepatic specific promoter, a luciferase gene reporter and a kanamycin resistance gene (pLIVE.luc) for bacteria selection by using the Takara Bio USA In-Fusion® HD Cloning kit. After that, Syt1 presence and function was verified by different methods including cell culture and animal experimentation. Results and discussion: Syt1 was successfully cloned and the transfection proves control’s expression and case’s overexpression proving that Syt1 is expressed in liver and a successful overexpression. Conclusions: The plasmid design is satisfactory, the luciferase is a good plasmid functional marker prior to mRNA gathering and the pLIVE promotor proves to be hepatic tissue specific