Development of microdevices for proteome research and diagnosis

The basic goal of a proteomic microchip is to achieve efficient and sensitive high throughput protein analyses, automatically carrying out several measurements in parallel. A protein microchip would either detect a single protein or a large set of proteins for diagnostic purposes, basic proteome or functional analysis. Such analyses would include e.g. interactomics, general protein expression studies, detecting structural alterations or secondary modifications. Visualization of the results may occur by simple immunoreactions, general or specific labelling, or mass spectrometry. For this purpose we have manufactured chip-based proteome analysis devices that utilize the classical polymer gel electrophoresis technology to run one and two-dimensional gel electrophoresis separations of proteins in just a smaller size. In total, we manufactured three functional prototypes of which one performed a miniaturized one-dimensional gel electrophoresis (1-DE) separation, the second and third preformed two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) separations. These microchips were successfully used to separate and characterize a set of predefined standard proteins, cell and tissue samples. Also, the miniaturized 2-DE (ComPress-2DE) chip presents a novel way of combining the 1st and 2nd dimensional separations, thus avoiding manual handling of the gels, eliminate cross-contamination, and make analyses faster and repeatability better. They all showed the advantages of miniaturization over the commercial devices; such as fast analysis, low sample- and reagent consumption, high sensitivity, high repeatability and inexpensive performance. All these instruments have the potential to be fully automated due to their easy-to-use set-up.Proteomisten mikrosirujen kehityksen tavoite on tuottaa tehokkaita ja herkkiä mittausmenetelmiä proteiinien laajamittaista analytiikkaa varten. Nämä sirut kykenevät analysoimaan suuren määrän näytteitä rinnakkain nopeasti ja täysin automaattisesti. Proteominen mikrosiru havaitsee joko yksittäisiä proteiinimuutoksia tai sarjan proteiinin yhtäaikaisia muutoksia. Siruja voidaan hyödyntää niin kliinisessä diagnostiikassa kuin myös biokemiallisessa perustutkimuksessa. Biokemiallisessa perustutkimuksessa voimme mitata eri proteiinien interaktioita, ilmentymistä rakennemuutoksia tai sekundaarisia muutoksia, esim fosforylaatiota. Tulosten havaitseminen voidaan toteuttaa yksinkertaisella immunovärjäyksellä, yleisillä tai spesifisillä leimoilla tai massaspektrometrialla. Tätä silmälläpitäen olemme kehittäneet mikrosiruja jotka hyödyntävät klassista yksi (1-DE) ja kaksisuuntaista (2-DE) geelielektroforeesitekniikkaa mutta paljon pienemmässä mittakaavassa kuin nykyisin. Rakensimme kolme prototyyppiä joista yksi käyttää yksisuuntaista - ja kaksi kaksisuuntaista geelielektroforeesia. Näitä mikrosiruja hyödynnettiin erottamaan kuusi eri proteiinia tunnetusta standardiseoksesta, sekä solu - ja kudos näytteille. Siruteknologia soveltui hyvin yksi- ja kaksisuuntaisen elektroforeesin automaattiseen yhdistämiseen samaan laitteeseen mahdollistaen näin puhtaamman näytekäsittelyn, nopean analyysin ja hyvän toistettavuuden, kaikki ominaisuuksia joita nykyinen laiteteknologia ei pysty tarjoamaan. Siruteknologia antaa mahdollisuuden paljon pienempien näytemäärien sekä käyttökemikaalien käytölle säästäen näin tuntuvasti yksittäisen analyysin kustannuksia. Laitteita kokeiltiin lopuksi kahteen kliiniseen näytteeseen joista toisessa erotimme proteiinisokeriketjuvariaatioita diabetes potilaan verestä ja toisessa Alzheimer-potilaan aivonäytteessä ilmenevää hyperfosforyloitua proteiinia

A cooperative mechanism drives budding yeast kinetochore assembly downstream of CENP-A

Kinetochores are megadalton-sized protein complexes that mediate chromosome–microtubule interactions in eukaryotes. How kinetochore assembly is triggered specifically on centromeric chromatin is poorly understood. Here we use biochemical reconstitution experiments alongside genetic and structural analysis to delineate the contributions of centromere-associated proteins to kinetochore assembly in yeast. We show that the conserved kinetochore subunits Ame1$^{CENP-U}$ and Okp1$^{CENP-Q}$ form a DNA-binding complex that associates with the microtubule-binding KMN network via a short Mtw1 recruitment motif in the N terminus of Ame1. Point mutations in the Ame1 motif disrupt kinetochore function by preventing KMN assembly on chromatin. Ame1–Okp1 directly associates with the centromere protein C (CENP-C) homologue Mif2 to form a cooperative binding platform for outer kinetochore assembly. Our results indicate that the key assembly steps, CENP-A recognition and outer kinetochore recruitment, are executed through different yeast constitutive centromere-associated network subunits. This two-step mechanism may protect against inappropriate kinetochore assembly similar to rate-limiting nucleation steps used by cytoskeletal polymers

A cooperative mechanism drives budding yeast kinetochore assembly downstream of CENP-A

Kinetochores are megadalton-sized protein complexes that mediate chromosome–microtubule interactions in eukaryotes. How kinetochore assembly is triggered specifically on centromeric chromatin is poorly understood. Here we use biochemical reconstitution experiments alongside genetic and structural analysis to delineate the contributions of centromere-associated proteins to kinetochore assembly in yeast. We show that the conserved kinetochore subunits Ame1$^{CENP-U}$ and Okp1$^{CENP-Q}$ form a DNA-binding complex that associates with the microtubule-binding KMN network via a short Mtw1 recruitment motif in the N terminus of Ame1. Point mutations in the Ame1 motif disrupt kinetochore function by preventing KMN assembly on chromatin. Ame1–Okp1 directly associates with the centromere protein C (CENP-C) homologue Mif2 to form a cooperative binding platform for outer kinetochore assembly. Our results indicate that the key assembly steps, CENP-A recognition and outer kinetochore recruitment, are executed through different yeast constitutive centromere-associated network subunits. This two-step mechanism may protect against inappropriate kinetochore assembly similar to rate-limiting nucleation steps used by cytoskeletal polymers