Setup and optimization of phosphoproteomic methodologies for the analysis of tissues from DUSP8 CRISPR-knockout mice

Το μονοπάτι των πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνα (MAPKs) συμμετέχει σε πολλές διαφορετικές βιολογικές διεργασίες, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η κυτταρική διαφοροποίηση, επιβίωση, απόπτωση και φλεγμονή. Σχετίζεται και με μια πληθώρα ασθενειών, όπως ο καρκίνος και o νευροεκφυλισμός. Αποτελείται από μία αλληλουχία αντιδράσεων φωσφορυλίωσης που χωρίζεται σε τρία επίπεδα και οδηγεί είτε στην ενεργοποίηση ενός πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα για τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων είτε στην ενεργοποίηση κάποιας κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης. Περιλαμβάνει τρεις μεγάλες υποοικογένειες: Τις ERK1/2 κινάσες, τις p38 κινάσες και τις c-Jun N-terminal κινάσες (JNK). Ακόμη κι αν κάθε επιμέρους μονοπάτι συμμετέχει γενικά σε διαφορετικές διεργασίες, υπάρχουν συχνά φαινόμενα όπου παρατηρείται συνενεργοποίηση και συρρύθμιση, ειδικά στην περίπτωση των JNK/p38 κινασών, που είναι γνωστές και σαν κινάσες που ενεργοποιούνται από το στρες (SAPKs). Η δράση των MAPKs ρυθμίζεται από μία συγκεκριμένη ομάδα φωσφατασών, τις φωσφατάσες των πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνα (MKPs). Οι MKPs ανήκουν σε μία μεγαλύτερη ομάδα πρωτεϊνών, τις φωσφατάσες διπλής ειδικότητας (DUSPs). Η διατριβή αυτή επικεντρώνεται στην DUSP8, μια φωσφατάση ειδική για JNK/p38 κινάσες, και στην αναστολή της από το αρσενικό, έναν παράγοντα που προκαλεί οξειδωτικό στρες και ενισχύει το μονοπάτι των JNK κινασών. Το πρώτο μέρος της διατριβής αφορά τη βελτιστοποίηση ενός πρωτοκόλλου φωσφοπρωτεομικής, από το βήμα της κυτταρικής καλλιέργειας ως το βήμα της ανάλυσης δεδομένων. Η ανάλυση με western χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα αντισώματα σε λύματα HEK293T κυττάρων που είχαν καλλιεργηθεί σε διαφορετικές περιόδους στρεσογόνας διέγερσης, παρείχαν πληροφορίες σχετικά με τις περιόδους διέγερσης με αρσενικό όπου παρατηρήθηκαν σαφείς επιδράσεις στα γενικά επίπεδα φωσφορυλίωσης. Το αρσενικό φάνηκε να διεγείρει αποτελεσματικά την αύξηση των γενικών επιπέδων φωσφορυλίωσης. Τα βήματα που επακολούθησαν ήταν ο προσδιορισμός των παραμέτρων του φασματογράφου μάζας (MS) και η επιλογή της μεθόδου προετοιμασίας δειγμάτων, η οποία μετά από εμπλουτισμό του δείγματος σε φωσφοπεπτίδια και nanoLC-MS/MS ανάλυση θα συνείσφερε στην ταυτοποίηση του μεγαλύτερου αριθμού πρωτεϊνών και πεπτιδίων. Οι εξεταζόμενες μέθοδοι προετοιμασίας δειγμάτων ήταν οι εξής τρεις: Μέθοδος προετοιμασίας με τη χρήση φίλτρων (FASP), μέθοδος προετοιμασίας ενισχυμένη με στερεά φάση (SP3) και πέψη βασισμένη σε τριφθοροαιθανόλη (TFE). Οι πιο κατάλληλες περίοδοι, παράμετροι και μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν στο δεύτερο μέρος της διατριβής, το οποίο περιλάμβανε τη φωσφοπρωτεομική LC-MS/MS ανάλυση εμβρυικών ινοβλαστών ποντικών. Τα κύτταρα αυτά λήφθηκαν από DUSP8-KO ποντίκια που δημιουργήθηκαν με την τεχνολογία CRISPR και από ποντίκια αγρίου τύπου της ίδιας γέννας. Η φωσφορυλίωση των πεπτιδίων εντοπίστηκε σε μεγαλύτερα επίπεδα στην περίπτωση των ινοβλαστών από τα DUSP8-KO ποντίκια. Δεν εντοπίστηκαν σχεδόν καθόλου φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα τυροσίνης, πιθανώς λόγω της παροδικής τους φύσεως. Επίσης, παρατηρήθηκε αυξημένη φωσφορυλίωση υποστρωμάτων της κινάσης ERK2 στους ινοβλάστες των DUSP8-KO ποντικών, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή ρύθμιση της ERK2 από την DUSP8. Στο τελευταίο μέρος έγινε συγκριτική ανάλυση του ολικού πρωτεόματος ιστών από DUSP8-KO ποντίκια και ποντίκια αγρίου τύπου της ίδιας γέννας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερενεργοποίηση του μονοπατιού των JNK κινασών, λόγω απώλειας της DUSP8 στην περιοχή του εγκεφάλου, πιθανώς οδηγεί σε μιτοχονδριακή απόπτωση και νευροεκφυλισμό. Επιπροσθέτως, η κυτταρική απόκριση στο οξειδωτικό στρες μέσω του μονοπατιού ERK1/2 στην περιοχή του εγκεφάλου των DUSP8-KO ποντικών καθοδηγείται κυρίως από την αυξημένη έκφραση της κινάσης B-Raf, μίας από τις πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν στη συγκριτική ανάλυση του ολικού πρωτεόματος.The Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathway is involved in many different biological processes, including cell proliferation, differentiation, survival, apoptosis and inflammation and is associated with a variety of pathological diseases, like cancer and neurodegeneration. It consists of a three-level cascade of phosphorylation events which either lead to the activation of a nuclear transcription factor for gene expression regulation or the activation of a cytoplasmic protein. The MAPK pathway includes three major subfamilies: the extracellular-signal regulated kinase (ERK1/2), the p38 kinase and the c-Jun N-terminal kinase (JNK) subfamilies. Even though each pathway is involved in different biological processes, events of co-activation and co-regulation are quite frequent, especially in the case of JNK/p38 kinases, which are also called stress-activated protein kinases (SAPKs). MAP kinase activity is regulated by a specific group of phosphatases called mitogen activated protein kinase phosphatases (MKPs). MKPs belong to a larger group called dual specificity phosphatases (DUSPs). This three-part project focuses on DUSP8, a JNK/p38 specific phosphatase, and its inhibition by arsenite, a JNK pathway-enhancing and oxidative stress inducing agent. The first part concerned the optimization of a phosphoproteomics workflow from cell culture to data analysis. Immunoblotting with specific antibodies of lysates from differentially starved and stimulated HEK293T cells provided information about the arsenite stimulation conditions, where a clear effect of phosphorylation was observed. Arsenite was found to be effective in the overall stimulation of phosphorylation. The following steps were to determine the mass spectrometry (MS) parameters and the sample preparation method with the highest protein and peptide yield after phosphopeptide enrichment and nanoLC-MS/MS analysis. Three methods were examined: Filter-aided sample preparation (FASP), solid-phase-enhanced sample preparation (SP3) and Trifluoroethanol-based digestion (TFE). Determined stimulation periods, MS parameters and sample preparation methods were then implemented in the second part of the project, which involved the phosphoproteome LC-MS/MS analysis of primary mouse embryonic fibroblasts derived from DUSP8-KO mice generated by CRISPR technology, and their WT littermates. Increased phosphorylation on a large number of proteins was detected in DUSP8-KO MEFs. Almost no phosphotyrosine residues were detected, possibly due to their transient nature. Also, increased phosphorylation of ERK2 substrates in DUSP8-KO MEFs suggested a possible regulation of ERK2 activity by DUSP8. In the last part, a comparative whole proteome analysis was conducted in tissues of DUSP8-KO mice and their WT littermates. The results suggested that overactivation of the JNK pathway due to DUSP8 deficiency in the brain leads to mitochondrial apoptosis and neurodegeneration. Additionally, the ERK1/2-driven response to oxidative stress in the brain of DUSP8-KO mice is possibly mediated by increased expression of B-Raf, one of the identified proteins in the comparative whole proteome analysis

Analyse von Hefeperoxisomen durch Spatial Proteomik

Peroxisomes are ubiquitous organelles with essential functions in numerous cellular processes such as lipid metabolism, detoxification of reactive oxygen species and signaling. Knowledge of the peroxisomal proteome including multi-localized proteins and, most importantly, changes of its composition induced by altering cellular conditions or impaired peroxisome biogenesis and function is of paramount importance for a holistic view on peroxisomes and their diverse functions in a cellular context. In this chapter, we provide a spatial proteomics protocol specifically tailored to the analysis of the peroxisomal proteome of baker's yeast that enables the definition of the peroxisomal proteome under distinct conditions and to monitor dynamic changes of the proteome including the relocation of individual proteins to a different cellular compartment. The protocol comprises subcellular fractionation by differential centrifugation followed by Nycodenz density gradient centrifugation of a crude peroxisomal fraction, quantitative mass spectrometric measurements of subcellular and density gradient fractions and advanced computational data analysis, resulting in the establishment of organellar maps on a global scale