Detection And Characterization Of Chicken Anemia Virus Isolated From Commercial Broiler Breeder Farms In Malaysia

Chicken anemia virus (CAV) is the causative agent of chicken infectious anemia (CIA). It is an economically important pathogen with a world-wide distribution. Study on the type of CAV isolates present and their genetic diversity, transmission to their progeny and level of protection afforded in the breeder farms is lacking in Malaysia. Hence, the present study was aimed to detect CAV from commercial broiler breeder farms using molecular, serological and immunohistochemical methods and characterize CAV positive samples based on sequence and phylogenetic analysis of partial VP1 gene. In the present study CAV DNA was detected in all 60 commercial broiler breeder hens obtained from 12 farms in three states of Malaysia. Results from ELISA also showed that 96.15% of blood samples collected from the same farms were positive for antibody against CAV supporting the finding from the nested PCR assay. Both of these findings indicate that CAV is widespread in commercial broiler breeder hens at least in the three states of Malaysia. Testing pooled embryonic tissue samples consisting of thymus, bursa of Fabricius and spleen together with egg shell membrane (ESM) showed positive embryos for CAV DNA in the range of 40% to 100% for different commercial broiler breeder farms despite the presence of neutralizing antibodies in majority of the hens (96.15%) tested for CAV antibodies. This shows high level of occurrence of vertical transmission of viral DNA to the progeny. The CAV antigen was also detected in the lymphocytes within the cortex of the thymus and in the hemocytoblasts of the bone marrow by indirect immunoperoxidase staining in some birds. The analysis of 165 amino acid portion of the VP1 protein of 12 isolates from commercial broiler breeder farms revealed unique amino acid residues proline (P) at amino acid position 22 and glutamine (G) at amino acid position 48 in isolates NF4A and PYT4, respectively. Generally, isolates from the commercial broiler breeder farms can be grouped into two based on their amino acid profile at positions 75, 97, 139 and 144. Seven of the isolates (NF4A, PPW4, P24A, P12B, M3B5, MF3C and MF1A) from the commercial broiler breeder farms had 75-I, 97-L, 139-Q and 144-Q and clustered together in cluster IIIa of the deduced amino acid phylogenetic tree whilst the remaining five isolates (M1B1, NF1D, NF2C, NF3A and PYT4) had similar 75-V, 97-M, 139-K and 144-E profile and found in cluster I and II of the deduced amino acid phylogenetic tree. When compared with previously published local field isolates, six isolates from the commercial broiler breeder farms (MF1A, MF3C, M3B5, NF4A, P12B and P24A) were found to have maximum homology with SMSC-1 isolate, four isolates (M1B1, NF3A, PYT4 and PPW4) were found to have maximum homology with BL-5 isolate and the remaining two (NF1D and NF2C) have similar maximum homology both with isolates 3-1 and BL-5. The sequence and phylogenetic analysis further indicated high similarity of current isolates from the commercial broiler breeder farms with isolates in this part of the globe while still having limited variation with isolates from different geographical places. The importance of unique amino acid substitutions observed in this study requires further research in order to identify the detail characteristics of the isolates

Molekularbiologischer Nachweis und Charakterisierung von durch Zecken übertragenen Pathogenen bei Rindern im Südwesten Äthiopiens

Tick-borne diseases (TBDs) affect 80% of the world’s cattle population, hampering livestock production throughout the world. Bovine babesiosis, anaplasmosis, heartwater and theileriosis have all been reported to occur in Ethiopia. However, little is known about the extent and prevalence of these diseases in the local cattle population. The principal aim of this thesis was to estimate the species composition and prevalence of bovine tickborne pathogens (TBPs) in Southwestern Ethiopia. The first paper of this cumulative thesis deals with the evaluation of six DNA extraction methods from blood spotted on Flinders Technology Associates (FTA) cards, to determine the optical protocol for the subsequent molecular detection of TBPs by PCR and reverse line blot (RLB) hybridization. Ten-fold serial dilutions of bovine blood infected with Babesia bovis, Theileria mutans, Anaplasma marginale or Ehrlichia ruminantium were made by dilution with uninfected blood and spotted on FTA cards. Subsequently, DNA was extracted from FTA cards using six different DNA extraction protocols. Additionally, DNA was also isolated from whole blood dilutions using a commercial kit. The findings from this study showed that (i) among the methods compared, the highest detection limit was observed when DNA was extracted from FTA cards using FTA purification reagent combined with elution with 5% Chelex® 100 resin. Secondly, the detection limit was improved when more discs were used as starting material for the DNA extraction, whereby the use of sixteen 3 mm discs proved to be most practical, (iii) comparisons of the detection limits of RLB and PCR for the four TBPs of cattle showed that the sensitivity of DNA extraction from FTA card vary between different TBPs and the sensitivity of the RLB was in nearly all instances 10x higher compared to gel electrophoresis. The second study aimed to determine the prevalence and species composition of bovine TBPs of veterinary significance in local cattle populations of Illubabor zone in Southwestern Ethiopia. The best method for the extraction of DNA from blood spotted on FTA cards as described above and a combination of PCR and a Reverse Line Blot (RLB) hybridization assay were employed for the detection of a broad-spectrum of TBPs (i.e. Babesia, Theileria, Anaplasma and Ehrlichia spp.) in blood samples collected from 392 cattle. The findings showed a high prevalence of several bovine TBPs in Southwest Ethiopia, some which are of great veterinary importance. Individual prevalences of these pathogens included Theileria mutans (66.1%), Theileria orientalis (51.8%), Anaplasma sp. Omatjenne (25.5%), Anaplasma marginale (14.5%), Babesia bigemina (14.0%) and Theileria velifera (13.0%) and minor occurrences of Ehrlichia ruminantium (0.5%) and Ehrlichia minasensis (0.26%). Ehrlichia minasensis was until now only reported from North and South America. In addition, three novel Anaplasma genotypes were detected in bovine blood samples. A phylogenetic analysis revealed that they most likely represent three, but at least two, new species. A total of 227 cattle (57.9%) were found to be coinfected with two or more TBPs simultaneously and 86 different species combinations were observed. The high frequency of co-infections observed in this study suggests that clinical manifestations might be complex and complicate their diagnosis. The data presented in this thesis provides a more informed picture of the epidemiology of infection of cattle with TBPs and contributes towards integrated and strategic control of ticks and TBDs in Ethiopia.Zecken-übertragene Krankheiten (TBDs), welche 80 % der weltweiten Rinderpopulation betreffen, haben einen negativen Einfluss auf die Nutzviehwirtschaft auf der ganzen Welt. Das Vorkommen der Babesiose, Anaplasmose, Herzwasserkrankheit und Theileriose bei Rindern in Äthiopien wurde beschrieben. Allerdings ist wenig bekannt über die Bedeutung und die Prävalenz dieser Krankheiten in den lokalen Rinderpopulationen Äthiopiens. Ziel dieser Dissertation war es daher, die Spezieszusammensetzung und die Prävalenz der von Zecken übertragenen Pathogene (TBP) in Rindern im Südwesten von Äthiopien zu bestimmen. Die Dissertation gliedert sich in zwei Studien. Die erste Studie beschäftigt sich mit der Evaluierung von sechs DNS-Extraktionsmethoden. Eine Zehner-Verdünnungsreihe von Rinderblut, das mit Babesia bovis, Theileria mutans, Anaplasma marginale oder Ehrlichia ruminantium infiziert war, wurde durch Verdünnung mit nicht infiziertem Blut hergestellt und auf FTA-Karten („Flinders-Technology-Associates“ cards) übertragen. Anschließend wurde die DNS unter Verwendung von sechs verschiedenen DNS-Extraktionsmethoden aus den FTA-Karten extrahiert. Zusätzlich wurde vergleichend DNS aus den Proben mit einem handelsüblichen Extraktions-Kit isoliert. Ziel war es, das optimale Protokoll für eine sich anschließende molekulare Erfassung der von Zecken übertragenen Pathogene durch PCR und „Reverse-Line-Blot-Hybridisierung“ (RLB) zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass (i) unter den verglichenen Methoden die höchste Nachweisempfindlichkeit für die Erreger erreicht wurde, wenn die DNS aus FTAKarten unter Verwendung der FTA-Reinigungslösung, kombiniert mit der Elution mit 5% Chelex® 100-Harz, extrahiert wurde. Zweitens wurde die Nachweisgrenze verbessert, wenn mehrere Stanzproben von den FTA-Karten der gleichen Probe als Ausgangsmaterial für die DNS-Extraktion verwendet wurden, wobei die Verwendung von sechzehn 3 mm-Stanzproben sich als am praktischsten erwies. (iii) Vergleiche der Nachweisgrenzen von RLB und PCR für die durch Zecken übertragenen Pathogene für Rinder zeigten, dass die Empfindlichkeit der DNS-Extraktion aus den FTA-Karten zwischen verschiedenen TBPs variierte und die Empfindlichkeit der RLB-Hybridisierung in fast allen Fällen 10x höher war als im Vergleich zur Gelelektrophorese. In der zweiten Studie sollte die Prävalenz und Spezieszusammensetzung der TBPs in den lokalen Rinderpopulationen in der Region von Illubator, im Südwesten von Äthiopien, bestimmt werden. Die Extraktionsmethode mit der höchsten Nachweisempfindlichkeit (FTA-Reinigungslösung kombiniert mit 5% Chelex® 100-Harz) wurde in Kombination mit der PCR und einem RLB-Hybridisierungsassay für die Detektion eines breiten Spektrums von TBPs angewandt. Insgesamt wurden Blutproben von 392 Rinder auf die Erreger aus vier TBP-Gattungen untersucht (Babesia spp., Theileria spp., Anaplasma spp. und Ehrlichia spp.). Die Ergebnisse zeigen eine hohe Prävalenz mehrerer Rinder-TBPs in Südwest-Äthiopien, von denen einige eine große veterinärmedizinische Bedeutung haben. Die Prävalenz dieser Pathogene betrug für Theileria mutans (66,1%), Theileria orientalis (51,8%), Anaplasma sp. Omatjenne (25,5%), Anaplasma marginale (14,5%), Babesia bigemina (14,0%), Theileria velifera (13,0%), Ehrlichia ruminantium (0,5%) und Ehrlichia minasensis (0,26%). Ehrlichia minasensis war zuvor ausschließlich in Rinderproben aus Nord- und Südamerika nachgewiese worden. Zusätzlich wurden drei neue Anaplasma-Genotypen in Rinderblutproben identifiziert. Eine phylogenetische Analyse zeigte ferner, dass diese höchstwahrscheinlich drei, zumindest aber zwei, neue Arten darstellen. Insgesamt waren 227 Rinder (57,9%) mit zwei oder mehreren TBPs gleichzeitig infiziert. Dabei wurden 86 verschiedene Spezieskombinationen beobachtet. Die in dieser Studie beschriebene Häufigkeit von Ko-Infektionen deutet darauf hin, dass klinische Manifestationen komplex sein können und daher eine Diagnose verkomplizieren können. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten ergeben einen Überblick über das Artenspektrum und die Prävalenz der von Zecken übertragenen Pathogene bei Rindern im Südwesten von Äthiopien. Die epidemiologischen Daten liefern eine wichtige Voraussetzung für eine strategische und nachhaltige Kontrolle der Zecken und der durch sie im Untersuchungsgebiet übertragenen Erreger

Adaptation of Proteasomes and Lysosomes to Cellular Environments

Protein degradation is important for proper cellular physiology as it removes malfunctioning proteins or can provide a source for energy. Proteasomes and lysosomes, through the regulatory particles or adaptor proteins, respectively, recognize proteins destined for degradation. These systems have developed mechanisms to allow adaptation to the everchanging environment of the cell. While the complex recognition of proteins to be degraded is somewhat understood, the mechanisms that help switch the proteasomal regulatory particles or lysosomal adaptor proteins to adjust to the changing landscape of degrons, during infections or inflammation, still need extensive exploration. Therefore, this review is focused on describing the protein degradation systems and the possible sensors that may trigger the rapid adaptation of the protein degradation machinery