Estratégias para a embriogênese somática e conservação ex situ de germoplasma de macaúba [Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart.]

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, 2013.O presente trabalho objetivou estabelecer estratégias para a clonagem por embriogênese somática e conservação ex situ de macaúba (Acrocomia aculeata). Para a embriogênese somática a partir de embriões zigóticos (EZ), foram avaliados o efeito das auxinas 2,4-D, dicamba e picloram nas concentrações de 0, 1,5 e 3,0 mg L-1, assim como os meios de cultura de MS e Y3. Na diferenciação de embriões somáticos (ES) as concentrações das auxinas foram reduzidas para 0,5 e 1,0 mg L-1. A regeneração de plantas foi realizada em meio de cultura desprovido de auxina. A formação de calos embriogênicos (CE) foi observada em todas as auxinas e concentrações testadas e, entre os meios de cultura foi observado resultados significativos com o uso de meio Y3. ES foram observados após 60 dias em meio de diferenciação e a frequência de regeneração de plantas atingiu valores de até 31,9%. Na embriogênese somática a partir de segmentos foliares de plantas in vitro, EZ foram germinados em meio Y3 contendo 0 e 225 μM de 2,4-D (pré-tratamento). A parte aérea das plantas foi dividida e seccionada em quatro regiões: meristemática, basal, mediana e apical. Os segmentos de cada região foram inoculados em meio contendo 450 μM de picloram para a indução de calos. Neste experimento, a diferenciação de ES ocorreu em meio com 40 e 80 μM de picloram. O uso do pré-tratamento de indução aumentou a capacidade de formação de CE e de ES. A região meristemática foi a que apresentou os melhores resultados. Em ambos os meios de diferenciação observou-se ES formados. Para aquisição da competência para formação de calos a partir de folhas e ovários imaturos de plantas adultas, foram avaliados o efeito das auxinas 2,4-D, dicamba e picloram, os meios de cultura de MS e Y3, as regiões basal e apical do palmito, quatro tipos de explantes provenientes de ovários imaturos e três classes quanto ao estádio de desenvolvimento das inflorescências. A auxina picloram associada à concentração de 450 μM proporcionou resultados superiores na indução de CE, em ambos os explantes testados. O meio Y3 aumentou a formação de calos em explantes foliares, porém, não teve influência nos explantes provenientes de flores femininas. Para a conservação de germoplasma de macaúba a médio-longo prazo, as sementes foram avaliadas quanto a tolerância à dessecação por até 168 horas. Após a determinação da melhor umidade para o armazenamento (5% de umidade), as sementes foram armazenadas a -196, -20, 6 e 25 °C por períodos de 0, 90, 180 e 360 dias. Para avaliar a viabilidade e germinação após cada período de armazenamento, as sementes foram desinfestadas e os EZ excisados e cultivados in vitro. Os resultados indicaram que as sementes de macaúba podem ser dessecadas para valores de até 4,3% de umidade, sem perda da viabilidade e com germinabilidade superior a 90%. As sementes armazenadas apresentaram perda da viabilidade ao longo dos períodos de avaliação em todas as temperaturas de conservação testadas, indicando que a categoria subortodoxa seja mais adequada para classificar as sementes desta espécie. No experimento de criopreservação de embriões zigóticos, esses foram extraídos de sementes e reidratados por 15 h em meio contendo 3% de sacarose. Em seguida, os EZ foram submetidos a dessecação por até 8 horas. Para cada período, parte dos embriões foi inoculada em meio de germinação e parte foi colocada em criotubos estéreis e imersos diretamente em nitrogênio líquido por até 360 dias. Após os período de armazenamento, foi realizado o descongelamento rápido dos criotubos em banho-maria a 40 °C por 90 segundos. Os resultados revelaram que há diminuição da germinabilidade com o aumento do tempo de dessecação dos EZ, com médias de 97 e 75% para 0 horas e 8 horas de dessecação, respectivamente. Para os embriões zigóticos criopreservados, a maior percentagem de germinação (81%) foi obtida após 6 horas de dessecação, quando os embriões apresentavam 11% de umidade. O presente trabalho contribui com informações relevantes tanto para a propagação vegetativa quanto para a conservação dessa espécie. Verificou-se que a embriogênese somática pode ser obtida a partir de diferentes fontes de explantes e a criopreservação pode representar uma nova estratégia para a conservação de germoplasma de macaúba por longos períodos. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACTThis study aimed to establish strategies for cloning by somatic embryogenesis from different explants and evaluate the desiccation tolerance and medium to long term storage of seeds and zygotic embryos of macaw palm (Acrocomia aculeata) for ex situ conservation. For the somatic embryogenesis from zygotic embryos (ZE) the effect of the auxin 2,4-D, dicamba and picloram at concentrations of 0, 1.5, and 3.0 mg L -1 and culture media MS and Y3, were evaluated. For the differentiation of somatic embryos (SE), the concentrations of auxin was reduced to 0.5 and 1.0 mg L- 1. Plant regeneration was performed in culture medium without auxin. The formation of embryogenic calli (EC) was higher in Y3 medium. SE were observed after 60 days in differentiation medium. The frequency of plant regeneration reached values of up to 31.9%. In somatic embryogenesis from leaf segments of in vitro plants, the effect of using a pre-induction treatment on calli and somatic embryo formation and was evaluated and more responsive explants characterized. For this, ZE were germinated in Y3 containing 0 and 225 μM of 2,4-D (pre-treatment). The aerial part of the plant was sectioned into four regions: meristematic, basal, median and apical. The segments from each region were inoculated in medium containing 450 μM of picloram for calli induction. The differentiation of SE occurred in medium with 40 and 80 μM of picloram. The use of the pretreatment increased the ability to induce the formation of EC as well as SE. The meristematic region showed superior results in the induction of EC and SE compared to the other regions tested. In both differentiation media we observed differentiated SE. In the acquisition of competence for calli formation from young imature and ovaries, we evaluated the effect of auxins 2,4-D, dicamba and picloram, the culture media MS and Y3, the basal and apical foliar regions of the palmetto tree, four types of explants from ovaries and three inflorescence development stage classes. The auxin, picloram associated with concentration of 450 μM, showed superior results in the induction of EC in both explants tested. The Y3 medium increased calli formation in leaf explants, however, it did not influence explantes from ovaries. For the conservation of macaw palm seed germplasm over the medium to long term, the seeds were evaluated for tolerance to desiccation for up to 168 hours. After determining the best moisture content for storage (5% moisture), seeds were stored at -196, -20, 6, and 25° C for 0, 90, 180 and 360 days. To assess the viability and germination after each storage period, the seeds were desinfested and ZE excised and cultivated in vitro. The results indicated that the macaw palm seeds can be desiccated to up to 4.3% moisture, without loss of viability and with a germination rate above 90%. Seeds stored for 360 days showed loss of viability over the evaluation periods at all storage temperatures tested, indicating that the suborthodox category is more appropriate to classify the seeds of this species. Based on the seed conservation results obtained, cryopreservation of zygotic embryos presents a viable alternative for the germplasm conservation of this species. For this experiment, ZE were extracted from seeds and rehydrated for 15 h in medium containing 3% sucrose. The ZE were then subjected to drying in a laminar flow chamber 0, 2, 4, 6 and 8 hours. For each period, a portion of the embryos was inoculated in germination medium and a portion was placed in sterile vials and immersed directly into liquid nitrogen for up to 360 days. After each storage period, rapid thawing of the cryotubes was conducted in a water bath at 40° C for 90s. The desiccation results showed that germinability decreases with increased drying time, averaging 97 and 75% for 0 hours and 8 hours of desiccation, respectively. For cryopreserved zygotic embryos, the highest germination percentage (81%) was obtained after 6 hours of desiccation, when the embryos had 11 % moisture. Embryos cryopreserved with 11% moisture content for up to 360 days showed 75% survival. This study contributes information relevant to both vegetative propagation and for the conservation of genetic resources of this species. Somatic embryogenesis can be obtained from different explant sources, and cryopreservation of zygotic embryos may represent a new strategy for the conservation of macaw palm germplasm for long periods

Oil palm seeds tolerance to cryopreservation

O objetivo deste trabalho foi avaliar a tolerância de sementes de dendezeiro (Elaeis guineensis) à criopreservação. Cinco genótipos – CM589, C7201, C2528, C2001, C2501 – foram avaliados quanto à exposição ao nitrogênio líquido por sete dias. Os tratamentos foram repetidos três vezes e cada repetição foi formada por dez sementes. Cortes anatômicos foram realizados para comparação do efeito dos tratamentos nos embriões durante a germinação. A exposição ao nitrogênio líquido acelerou a germinação das sementes do genótipo CM589 e aumentou o potencial de germinação das sementes do genótipo C2528. A exposição ao nitrogênio líquido não teve efeito no genótipo C2501 e reduziu a germinação das sementes do genótipo C7201. A exposição ao nitrogênio líquido não interferiu na diferenciação e no desenvolvimento dos tecidos embrionários durante a germinaçãoThe aim of this work was to evaluate the oil palm (Elaeis guineensis) seed tolerance to cryopreservation. Five genotypes (CM589, C7201, C2528, C2001, and C2501) were evaluated with or without exposure to liquid nitrogen for seven days. Treatments were replicated three times with ten seeds per replicate. Serial anatomical cuts were made to compare the effect of treatments on zygotic embryos. For CM589 and C2528, the exposition to liquid nitrogen accelerated and increased seed germination, respectively. For C2501, liquid nitrogen had no effect. For C7201, liquid nitrogen reduced seed germination (90.7%) compared to the check (100%). Anatomically, the liquid nitrogen did not interfere with embryonic tissue differentiation or development during germinatio

Conservação de curto prazo in vitro e propagação em larga escala de genótipos de videira

O objetivo deste trabalho foi avaliar a propagação em larga escala de genótipos de videira após curto período de conservação in vitro. Foram utilizados microbrotos de dez genótipos de videira. As seguintes temperaturas de conservação foram avaliadas: 10, 20 e 25°C. Após o curto período de conservação, as brotações foram multiplicadas, por até cinco subcultivos sucessivos, para avaliar o potencial propagativo em larga escala do germoplasma mantido sob condições de crescimento mínimo. As brotações regeneradas foram enraizadas em diferentes concentrações de ácido indolbutírico (AIB) e aclimatizadas em casa de vegetação. A melhor temperatura para a conservação de curto prazo in vitro e para a sobrevivência dos genótipos foi a de 20°C. Na fase de multiplicação, o maior número de brotos foi verificado nos subcultivos 4 e 5, com médias de 4,9 e 4,8 brotos por explante, respectivamente. Na etapa de enraizamento, os melhores resultados para número de raízes foram obtidos em meio de cultura suplementado com 0,4 µmol L-1 de AIB, com média de três raízes por brotação. Durante a aclimatização, obteve-se índice de sobrevivência superior a 95%, após 30 dias de permanência em casa de vegetação. Genótipos de videira em conservação por seis meses in vitro, a 20ºC, podem ser micropropagados em larga escala.The objective of this work was to evaluate the large-scale propagation of grapevine genotypes after short-term storage in vitro. Microshoots from ten grapevine genotypes were used. The following storage temperatures were evaluated: 10, 20, and 25°C. After short-term storage, the shoots were propagated in up to five successive subcultures, to assess the large-scale propagation of the germplasm maintained under conditions of minimal growth. The propagated shoots were rooted in different concentrations of indolbutiric acid (IBA) and acclimatized in greenhouse. The best temperature for short-term storage in vitro and survival of the genotypes was 20°C. In the propagation phase, the highest number of shoots per explant was found in the subcultures 4 and 5, with averages of 4.9 and 4.8 shoots per explant, respectively. In the rooting phase, the best results for number of roots were obtained using a culture medium supplemented with 0.4 µmol L-1 of IBA, with an average of three roots per shoot. During the acclimation phase, a survival rate higher than 95% was achieved after 30 days in the greenhouse. Grapevine genotypes maintained for six months in vitro, at 20ºC, can be micropropagated in large scale

A IMPORTÂNCIA DAS ATIVIDADES DE MONITORIA NA DISCIPLINA DE MORFOLOGIA E SISTEMÁTICA VEGETAL I

A monitoria é considerada uma forma de apoio pedagógico oferecido aos alunos que tenham interesse em aprofundar conhecimentos em determinado tema ou ainda para resolver dúvidas relacionadas a disciplina ministrada em sala de aula. Além disso, auxiliar na docência, com a função pedagógica exercida por acadêmicos regularmente matriculados nos cursos de graduação, estimular o interesse pelo ensino, contribuindo para o aprofundamento técnico e científico do acadêmico e possibilitar a interação destes em atividades didáticas, ampliando a participação dos discentes nas atividades da academia (Haag et al 2008). Israel e Koppe (2009) constatam que a monitoria, em uma visão inovadora, pode oportunizar uma formação acadêmica contextualizada de acordo com o campo de atuação do aluno-monitor. Esse, por sua vez, dentro do contexto de ensino aprendizagem, auxilia o professor orientador nas metodologias que serão aplicadas em sala de aula, conseguindo evidente ganho intelectual pessoal, propiciado através das trocas de conhecimentos com o professor, como também, com os estudantes com quem vai compartilhar as experiências da monitoria e colaborar na aprendizagem. A monitoria em morfologia e sistemática vegetal I, disciplina do curso de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Sul e Sudeste do Pará (UNIFESSPA), envolve atividades básicas de classificação e a identificação de materiais botânicos, utilizando como base as características morfológicas dos vegetais. A taxonomia pode ser considerada teoria e prática que busca agrupar, no caso, as plantas, organizando-as em grupos. Nestes estão os indivíduos que possuem características morfológicas em comum, desenvolvendo a classificação, que tem como função organizar as informações sobre a planta, construindo chaves de classificação que servem para a identificação do material (Judd, 2009). Logo, a sistemática é a ciência que estuda a diversidade dos seres vivos, que engloba a descoberta e a descrição desses organismos. O estudo da Botânica é muito diversificado e realizado por meio de investigações descritivas e comparativas da morfologia dos vegetais, com o objetivo de chegar à compreensão da história evolutiva dos vegetais (Vidal e Vidal, 2003). Com isso, este trabalho teve como objetivo expor os resultados positivos e negativos obtidos pelo monitor em suas atividades auxiliando no ensino de morfologia e sistemática vegetal I

Short‑term storage in vitro and large‑scale propagation of grapevine genotypes

The objective of this work was to evaluate the large‑scale propagation of grapevine genotypes after short‑term storage in vitro. Microshoots from ten grapevine genotypes were used. The following storage temperatures were evaluated: 10, 20, and 25°C. After short‑term storage, the shoots were propagated in up to five successive subcultures, to assess the large‑scale propagation of the germplasm maintained under conditions of minimal growth. The propagated shoots were rooted in different concentrations of indolbutiric acid (IBA) and acclimatized in greenhouse. The best temperature for short‑term storage in vitro and survival of the genotypes was 20°C. In the propagation phase, the highest number of shoots per explant was found in the subcultures 4 and 5, with averages of 4.9 and 4.8 shoots per explant, respectively. In the rooting phase, the best results for number of roots were obtained using a culture medium supplemented with 0.4 μmol L‑1 of IBA, with an average of three roots per shoot. During the acclimation phase, a survival rate higher than 95% was achieved after 30 days in the greenhouse. Grapevine genotypes maintained for six months in vitro, at 20oC, can be micropropagated in large scale.The objective of this work was to evaluate the large‑scale propagation of grapevine genotypes after short‑term storage in vitro. Microshoots from ten grapevine genotypes were used. The following storage temperatures were evaluated: 10, 20, and 25°C. After short‑term storage, the shoots were propagated in up to five successive subcultures, to assess the large‑scale propagation of the germplasm maintained under conditions of minimal growth. The propagated shoots were rooted in different concentrations of indolbutiric acid (IBA) and acclimatized in greenhouse. The best temperature for short‑term storage in vitro and survival of the genotypes was 20°C. In the propagation phase, the highest number of shoots per explant was found in the subcultures 4 and 5, with averages of 4.9 and 4.8 shoots per explant, respectively. In the rooting phase, thebest results for number of roots were obtained using a culture medium supplemented with 0.4 μmol L‑1 of IBA, with an average of three roots per shoot. During the acclimation phase, a survival rate higher than 95% was achieved after 30 days in the greenhouse. Grapevine genotypes maintained for six months in vitro, at 20oC, can be micropropagated in large scale

Germinative potential and leaf morphoanatomy of physic nut seedlings from cryopreserved germplasm

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial germinativo e caracterizar morfoanatomicamente a estrutura foliar de plântulas de pinhão-manso originadas de germoplasma criopreservado. Inicialmente, as sementes foram avaliadas quanto à dessecação, a cada 24 horas, por até 120 horas. Posteriormente, as sementes foram dessecadas por 0, 24 e 48 horas e avaliadas mensalmente quanto ao potencial germinativo, antes e após armazenamento em nitrogênio líquido por imersão direta e congelamento rápido. Para caracterizar a viabilidade das sementes que não germinaram após o período de avaliação, os embriões zigóticos foram imersos em solução de tetrazólio. A morfoanatomia foliar após criopreservação foi caracterizada por meio de estudos histológicos. As sementes de pinhão-manso toleraram a dessecação a níveis críticos e a criopreservação com umidade em torno de 8%. A dessecação das sementes até valores baixos, associada a períodos prolongados de exposição ao nitrogênio líquido, causa anormalidade de plântulas, danifica as células e os tecidos das folhas, e afeta negativamente a germinação.The objective of this work was to evaluate the germinative potential and the morphoanatomical features of leaves in seedlings of physic nut from cryopreserved germplasm. Initially, seeds were evaluated regarding desiccation every 24 hours for up to 120 hours. Then, seeds were desiccated for 0, 24, and 48 hours, and evaluated monthly as to germinative potential, before and after storage in liquid nitrogen by direct immersion and fast freezing. To characterize the viability of seeds that did not germinate after the evaluation period, the zygotic embryos were immersed in tetrazolium solution. Morphoanatomical features of leaves were determined after cryopreservation by histological evaluation. Physic nut seeds tolerated desiccation to critical levels and cryopreservation with moisture content around 8%. Seed desiccation to lower values, associated with longer periods of exposition to liquid nitrogen, causes abnormalities in seedlings, damages leaf cells and tissues, and affects negatively germination

Cell differentiation and plant regulators on banana

Altos custos de produção geralmente limitam o uso comercial da micropropagação. O uso de meios de cultura líquidos é considerado uma solução para a automação e redução de custos. Entretanto, dependendo da cultivar de bananeira, esse processo pode mostrar diferentes níveis de dificuldade, e adaptações nos protocolos são necessárias. Neste estudo, experimentos de diferenciação celular e regeneração de plantas foram desenvolvidos em células em suspensão de banana pela avaliação da densidade inicial de células, meios de cultura e sistemas de imersão temporária. Para tanto, uma sequência de três experimentos foi realizada: o primeiro avaliou os efeitos da densidade celular (0,5; 1 e 2 mL), meios de cultura (M1: 1/2MS, 0,1 g.L-1 de ácido ascórbico, 0,1 g.L-1 de L-prolina, 30 g.L-1 de sacarose e 10 µM de 2iP; M2: MS, 30 g.L-1 de sacarose, 2,2 µM de BAP e 11,4 µM de AIA) e períodos de diferenciação celular (40 e 130 dias); o segundo experimento analisou o efeito do tamanho dos propágulos diferenciados em meio líquido (aprox. 2,5; 5 e 10 mm em diâmetro) na formação de embriões somáticos ou na regeneração de plantas; finalmente, um terceiro experimento avaliou o efeito de sistemas de cultivo com papel-filtro cobrindo o meio de cultura semissólido e sistemas de imersão temporários na diferenciação dos propágulos e na regeneração de plantas. Não foram observadas diferenças significativas entre os meios de diferenciação, porém as melhores diluições de células para a diferenciação foram de 1 e 2 mL/30mL de meio de cultura, enquanto diluições de 0,5 mL/30 mL de meio aumentaram a oxidação celular. A extensão do período de diferenciação de 40 para 130 dias foi importante para produzir maior número de calos/propágulos uniformes e com pelo menos de 10 mm de diâmetro, que puderam ser usados em sistemas de imersão temporária (biorreatores) para a diferenciação de embriões somáticos e regeneração de plantas. Considerando todos os sistemas de regeneração, verificou-se que o uso de meios de regeneração de consistência semissólida com papel-filtro na superfície do meio é o mais responsivo para a diferenciação de embriões somáticos e regeneração de plantas.High production costs generally limit the commercial use of the in vitro micropropagation. The use of liquid media is considered to be the ideal solution for the automation and the production costs reduction. However, depending on the variety, this process can show different levels of difficulty and adaptations in protocols are needed. In this study experiments on cell differentiation and plant regeneration were carried out from banana cell suspension culture, by evaluating the initial cell density, the culture media and the temporary immersion systems. A sequence of three experiments was performed: the first one evaluated the effects of cell density (0.5; 1 and 2), culture media (M1: 1/2MS, 100 g.L-1 ascorbic acid, 100 mg.L-1 L-proline, 30 g.L-1 sucrose and 10 µM 2iP; M2: MS, 30 g.L-1 sucrose, 2,2 µM BA and 11,4 µM IAA) and the period of cells differentiation (40 and 130 days). The second one analyzed the effect of propagules size differentiated in liquid media (approx. 2.5; 5 and 10 mm diameter) on somatic embryo formation or plant regeneration. Finally, a third experiment analyzed the effects of culture systems with filter-paper-covered medium and temporary immersion systems, on propagules differentiation or plant regeneration. The results showed that no differences were found between both differentiation media, and the better cells densities for differentiation were 1 ml and 2 mL/30 mL medium, whereas dilutions of 2 mL/30 mL medium increased cell oxidation. Extending the period in the differentiation medium from 40 to 130 days was important to produce a higher number of uniform embryogenic propagules with 10 mm diameter, which can be used in temporary immersion systems (bioreactors) for embryo and plant regeneration. Considering all the regeneration systems, the semi-solid regeneration medium covered by filter-paper significantly increased the somatic embryo differentiation and plants regeneration

Propagação in vitro e caracterização anatômica de gemas adventícias e embriões somáticos de murici (Byrsonima basiloba Juss., Malpighiaceae)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Botânica, 2008.O murici (B. basiloba) é um arbusto do Cerrado, cujos frutos são bastante apreciados, sendo consumidos in natura ou processados artesanalmente. Esta planta apresenta dificuldades de propagação sexuada. O objetivo do presente trabalho foi otimizar um protocolo de micropropagação para esta espécie, através de gemas apicais e adventícias obtidas de plântulas germinadas in vitro. Sementes de B. basiloba foram esterilizadas e germinadas em água e ágar. Gemas apicais e axilares adjacentes foram utilizadas na multiplicação em cinco subculturas. Para multiplicação foi utilizado meio MS e ½ MS, suplementado com BAP (6-benzilaminopurina) ou combinado com AIB (ácido indol-3- butírico) e cinetina, acrescido de 20 g.L-1 de sacarose, 0,1 g.L-1 de inositol e 7 g.L-1 de ágar. Testou-se também a influência de carvão ativado. Não houve diferença entre o meio MS pleno e o diluído. A combinação BAP, AIB e CIN produziu maior quantidades de brotos, nas concentrações 0,5, 1,0 e 0,2 mg.L-1 respectivamente. Para aumentar a eficiência na produção de brotos utilizando carvão ativado adicionado ao meio, é necessário aumentar as concentrações hormonais, caso contrário o meio promove apenas o alongamento dos brotos. O uso do carvão ativado foi essencial antes da etapa de enraizamento. Utilizou-se a mistura de talco neutro e AIB na base dos brotos, para o enraizamento ex vitro, que resultou em 47% dos brotos enraizados e aclimatados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe murici (B. basiloba) is a shrubby plant of the Cerrado biome, and its fruits are consumed fresh or as homemade sweeties. This species is difficult to be propagated by sexual reproduction. Therefore, the purpose of this work is to optimize a micropropagation protocol for this plant species using as explants the apical and adventitious buds taken from in vitro germinated seeds. Seeds of B. basiloba were sterilized and germinated in agar water medium. The apical and the adjacent buds were micropropagated in five subsequent multiplication subcultures. The multiplication medium was either MS or ½ MS, supplemented with 6- benzylaminopurine (BAP) alone or in combination with indole- -butyric acid (IBA) or kinetin (KIN) plus 20 g.L-1 of sucrose, 0.1 g.L-1 myo-inositol, 7.0 g.L-1 of agar. Furthermore, the influence of activated charcoal was tested during explant multiplication and elongation. There were no significant differences between the two media tested (MS and ½ MS) in the explant multiplication rate. The combination of 0.5 mg.L-1 BAP, 1.0 mg.L-1 IBA, and 0.2 mg.L-1 KIN was the most effective in inducing sprouting. The activated charcoal was essential to elongate the explants before rooting. Nonetheless, to keep a high rate of multiplication after the addition of activated charcoal in the medium it was necessary to increase the concentration of the hormones. Rooting was induced ex vitro with a mixture of talcum powder and IBA at the basal region of the sprout, and 47% of the explants were rooted and acclimatized