Peripheral blood derived gene panels predict response to infliximab in rheumatoid arthritis and Crohn’s disease

Background: Biological therapies have been introduced for the treatment of chronic inflammatory diseases including rheumatoid arthritis (RA) and Crohn's disease (CD). The efficacy of biologics differs from patient to patient. Moreover these therapies are rather expensive, therefore treatment of primary non-responders should be avoided. Method: We addressed this issue by combining gene expression profiling and biostatistical approaches. We performed peripheral blood global gene expression profiling in order to filter the genome for target genes in cohorts of 20 CD and 19 RA patients. Then RT-quantitative PCR validation was performed, followed by multivariate analyses of genes in independent cohorts of 20 CD and 15 RA patients, in order to identify sets ofinterrelated genes that can separate responders from non-responders to the humanized chimeric anti-TNFalpha antibody infliximab at baseline. Results: Gene panels separating responders from non-responders were identified using leave-one-out cross-validation test, and a pool of genes that should be tested on larger cohorts was created in both conditions. Conclusions: Our data show that peripheral blood gene expression profiles are suitable for determining gene panels with high discriminatory power to differentiate responders from non-responders in infliximab therapy at baseline in CD and RA, which could be cross-validated successfully. Biostatistical analysis of peripheral blood gene expression data leads to the identification of gene panels that can help predict responsiveness of therapy and support the clinical decision-making process

Extracellular matrix differences in glioblastoma patients with different prognoses

L

Prognostic role of the expression of invasion-related molecules in glioblastoma.

Background Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant disease of the central nervous system. Its prognosis is unfavorable, and the median overall survival of patients is 16 to 24 months. The main cause of the poor survival data are the extensive invasion of cancer cells to the neighboring parenchyma, thus leading to inevitable local recurrence. The extracellular matrix (ECM) is a known factor in tumor invasion, and differences in the ECM of nontumor brain and glioblastoma has been proven. Methods In this research, 20 invasion-related expressions of ECM components were determined in 26 GBM flash-frozen samples using quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and proteomic measurements. Expression data were then set against the survival data of the patients. Results Significant alterations between groups with different survival rates could not be established in the individual evaluation of the expression level of the selected molecules. However, statistical analysis of the expression pattern of invasion-related molecules revealed a correlation with prognosis. The positive predictive values of the messenger RNA (mRNA) and the proteomic expression studies were 0.85 and 0.89, respectively. The receiver operation characteristic value was 0.775 for the mRNA expression data and 0.875 for the protein expression data. Furthermore, a group of molecules, including brevican, cadherin-12, integrin β1, integrin α3, laminin α4, and laminin β1, that play a prominent role in invasion were identified. Conclusions Joint assessment of the expression of invasion-related molecules provides a specific invasion spectrum of the tumor that correlates with the survival of glioblastoma patients. Using statistical classifiers enables the adoption of an invasion spectrum as a considerably accurate prognostic factor while gaining predictive information on potential molecular oncotherapeutic targets at the same time

A harmadik szinapszis. Molekuláris kölcsönhatások az elhaló sejtek és az azokat eltávolító makrofágok, dendritikus sejtek között. = The third synapsis. Molecular interactions between dying cells and macrophages or dendritic cells.

A tudományos iskola keretében új interdiszciplináris kutatási terület megteremtésére került sor az apoptótikus sejtek és az azokat eltávolító sejtek közötti harmadi szinapszis tanulmányozására. Megállapítottuk, hogy a transzglutamináz 2 (TG2) enzim szerepet játszik az apoptotikus sejtek eltávolításában, az enzim hiányában autoimmun kórkép alakúl ki. A TG2 bejuthat a sejmagba, sejtbiokémiai hatása összefügg génkifejeződés befolyásolásával. Alzheimer kórban a TG2 résztvesz kovalensen összekötött fehérje aggregátumok létrehozásában. A TG2 védőhatást fejt ki a sejtelhalással szemben májsejtekben és szívizomsejtekben G fehérje, ill. protein diszulfid izomeráz aktivitásával. A PPAR? szerepet játszik az apoptótikus sejteket eltávolító fagocitáló képesség kialakításában fokozva fagocitózis gének kifejeződését. A PPAR?, a retinoid receptor és az LXR receptor szignál utak összekapcsolódnak a makrofágok koleszterol szintjének szabályozásában. A PPAR? aktiváció hatására a dendritikus sejekből fokozott fagocitózisra, hatékony lipid prezentációra és iNKT aktivitásra képes alpopuláció alakul. Apopto-fagocita Taqman Low Density Array-t fejleszttünkl 94 gén mennyiségi kifejeződése vizsgálatára. Az autofágiával elhaló sejtek eltávolítása szintén fagocitózissal történik, specifikus gének indukálódnak. A dendritikus sejtek kölcsönhatása apoptótikus vagy nekrotikus sejtekkel alkalmas az immunválasz finom szabályozására. | In the supported Research School a new interdisciplinary research area has been developed to study the third synapse formed between apoptotic cells and those which engolfe them. It has been established that the transglutaminase 2 (TG2) enzyme plays an important role in the clearance of apoptotic cells, the lack of this enzyme leads to autoimmune disease. TG2 can enter the nucleus and its cell biochemical effects are related to modulation of gene expression and modification of the cytoskeleton. In Alzheimer's disease TG2 participates in the formation of covalently cross-linked protein aggregates. TG2 can protect hepatocytes and cardiomyocytes against apoptosis through its G protein and protein disulphide isomerase activities. PPARγ contributes to the development of phagocytic capacity of macrophages by inducing specific phagocytic genes. The PPARγ, rretinoid and LXR receptor signal pathways are interlinked in regulating cholesterol content of cells. Activation of PPARγ in dendritic cells leads to the development of a subpopulation with increased phagocytic capacity, effective lipid presentation and iNKT activity. An apopto-phagocytic Taqman Low Density array has been developed for quantitative measuring of 94 genes in parallel. Cells dying by autophagy are removed by the same mechanism as apoptotic cells while specific phagocytic genes are induced. Dendritic cells interacting with apoptotic cells can fine tune the immune system

Studies on the Substrate Specificity of Retroviral Proteinases and Caspases with the Methods of Enzimology, Molecular Biology and Molecular Modelling

A doktori értekezésemben felhasznált munkáim során alkalmam volt a retrovirális proteinázok HTLV-BLV csoportjába tartozó proteinázok fő képviselőinek (HTLV-I, BLV PR) előállítására, specificitásuknak egymással, illetve a HTLV-I PR specificitásának a HIV-1 PR-al történő összehasonlítására. Lehetőségem volt még a ciszteinil proteinázok egyik élettani szempontból igen fontos szereppel bíró családjának, a kaszpázoknak három képviselőjével kísérleteket végezni a szubsztrát-foszforiláció és a hasíthatóság összefüggéseinek a vizsgálatára, valamint mutáns kaszpáz-3 enzimek előállítására. Vizsgálataink a két enzimcsalád enzim-szubsztrát kölcsönhatásainak alapos megismerését szolgálták, miközben általános összefüggések felismerésére törekedtünk. BLV PR előállítása érdekében a proteináz cDNS-t fúziós vektorba (pMal-c2) klónoztuk, amelyből expresszáltattuk és tisztítottuk. A tisztítás során kiderült, hogy az enzim képes saját aktív formájának a kialakítására, az előállítását szolgáló konstrukcióból önmaga kihasítására, mind N- és C-terminális irányból. Sikerült az enzimet inklúziós testekből kinyernünk, majd kationcserés és gélszűréses módszerrel homogénre tisztítanunk. Tárolás során további részleges önprocesszálást tapasztaltunk, ami azonban nem járt szignifikáns aktivitáscsökkenéssel. A HTLV-I és BLV proteinázok specificitás-összehasonlítása alapján arra következtethetünk, hogy a BLV PR szélesebb specificitással rendelkezik mint a HTLV-I PR, de a specificitásbeli különbség közöttük – a szubsztrátkötő régiót alkotó részben található homológiával arányosan - nagyobb, mint ami a HIV-1 és HIV-2 PR között tapasztalható. A HTLV-I proteinázok specificitásvizsgálatait a már számos egyéb retrovíruscsalád reprezentatív képviselőjének jellemzésére is felhasznált HIV-1 MA/CA peptidsorozattal kívántuk elvégezni, de a vizsgálatok során kiderült, hogy a HTLV-BLV csoport képviselőinek a többi retrovirális proteinázétól való eltérő szubsztrátspecificitása miatt más sorozatot kell választanunk. A HTLV-I és a HIV-1 proteinázok közötti különbségek részleteit az alzsebek vonatkozásaiban a HTLV-I CA/NC peptidsorozattal tártuk fel. A vizsgálataink azt mutatták, hogy a HIV-1 proteinázoktól eltérően az S4 és S2 zsebek esetében döntően a hidrofób jellegű kölcsönhatások a meghatározóak, míg az S3, S1 és S1’ zsebek specificitásában nagyobb a hasonlóság. A HIV-1 MA/CA hasítási helyhez hasonlóan úgy tűnik, hogy a HTLV-I CA/NC hasítási hely is evolúciósan az újonnan szintetizálódó poliproteinek gyors hasítására szelektálódott ki, mivel a szubsztituált szubsztrátok nagy része lényegesen lassabban hasadt mint a szubsztituálatlan analógok. A kaszpáz specificitásvizsgálatainkat konkrét kérdéskörre szűkítettük, mivel az általános specificitásvizsgálatokat már korábban elkészítették. Ez a kérdéskör a foszforiláció volt, amely egy teljesen általános szabályozási mechanizmus. A foszforiláció proteolízisre kifejtett hatásának tanulmányozása a foszforilált aminosavak közvetlen szerepének feltárásával ritka az irodalomban. Számos esetben a foszfo-Ser mimikálása érdekében helyspecifikus mutagenezissel lecserélik a Ser oldalláncot aszpartátra és így próbálnak meg funkcionális következtetéseket levonni. Vizsgálataink bebizonyították, hogy legalábbis a kaszpázspecificitás tekintetében az Asp és a foszfo-Ser semmiképpen sem tekinthető ekvivalensnek: míg a kaszpáz-3, -7, -8 enzimek számára az Asp eszenciális a P1 pozícióban, és a P4 pozícióban is erősen preferált a kaszpáz-3 és -7 enzimek számára, a foszfo-Ser ugyanezen poziciókban erősen csökkentette vagy teljesen meggátolta a hasíthatóságot. Ebből adódóan a P1’ és P4 Ser oldalláncok foszforilációjának szabályozó szerepe lehet a fehérjék kaszpáz mediált lebontásában.Egyetemi Doktori (Ph.D.) Értekezés ; Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet, 2003Ph

Effect of caspase cleavage-site phosphorylation on proteolysis.

Caspases are important mediators of apoptotic cell death. Several cellular protein substrates of caspases contain potential phosphorylation site(s) at the cleavage-site region, and some of these sites have been verified to be phosphorylated. Since phosphorylation may affect substantially the substrate susceptibility towards proteolysis, phosphorylated, non-phosphorylated and substituted oligopeptides representing such cleavage sites were studied as substrates of apoptotic caspases 3, 7 and 8. Peptides containing phosphorylated serine residues at P4 and P1' positions were found to be substantially less susceptible towards proteolysis as compared with the serine-containing analogues, while phosphoserine at P3 did not have a substantial effect. P1 serine as well as P1-phosphorylated, serine-containing analogues of an oligopeptide representing the poly(ADP-ribose) polymerase cleavage site of caspase-3 were not hydrolysed by any of these enzymes, whereas the P1 aspartate-containing peptides were efficiently hydrolysed. These findings were interpreted with the aid of molecular modelling. Our results suggest that cleavage-site phosphorylation in certain positions could be disadvantageous or detrimental with respect to cleavability by caspases. Cleavage-site phosphorylation may therefore provide a regulatory mechanism to protect substrates from caspase-mediated degradation

Amino Acid Preferences for a Critical Substrate Binding Subsite of Retroviral Proteases in Type 1 Cleavage Sites

The specificities of the proteases of 11 retroviruses representing each of the seven genera of the family Retroviridae were studied using a series of oligopeptides with amino acid substitutions in the P2 position of a naturally occurring type 1 cleavage site (Val-Ser-Gln-Asn-Tyr↓Pro-Ile-Val-Gln; the arrow indicates the site of cleavage) in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). This position was previously found to be one of the most critical in determining the substrate specificity differences of retroviral proteases. Specificities at this position were compared for HIV-1, HIV-2, equine infectious anemia virus, avian myeloblastosis virus, Mason-Pfizer monkey virus, mouse mammary tumor virus, Moloney murine leukemia virus, human T-cell leukemia virus type 1, bovine leukemia virus, human foamy virus, and walleye dermal sarcoma virus proteases. Three types of P2 preferences were observed: a subgroup of proteases preferred small hydrophobic side chains (Ala and Cys), and another subgroup preferred large hydrophobic residues (Ile and Leu), while the protease of HIV-1 preferred an Asn residue. The specificity distinctions among the proteases correlated well with the phylogenetic tree of retroviruses prepared solely based on the protease sequences. Molecular models for all of the proteases studied were built, and they were used to interpret the results. While size complementarities appear to be the main specificity-determining features of the S2 subsite of retroviral proteases, electrostatic contributions may play a role only in the case of HIV proteases. In most cases the P2 residues of naturally occurring type 1 cleavage site sequences of the studied proteases agreed well with the observed P2 preferences

The Expressional Pattern of Invasion-Related Extracellular Matrix Molecules in CNS Tumors

L