Effect of two ram sperm capacitating media on acrosome reaction and zona-free hamster oocyte penetration test

Foram realizados 24 experimentos de penetração de espermatozóides de carneiros em oócitos zona-free de hamster com a finalidade de avaliar dois diferentes meios de capacitação espermática. Foi feito um "pool" do sêmen fresco de três carneiros mestiços, submetido à lavagem por centrifugação para retirada do plasma seminal e incubação em meio altamente iônico (HIS) ou em meio quimicamente definido acrescido de HEPES, soro de ovelha no cio e heparina, a fim de promover a capacitação dos espermatozóides. Foram utilizadas 96 hamsters fêmeas, superovuladas com os hormônios PMSG e hCG, que forneceram 3.069 oócitos, (média de 31,97 oócitos por fêmea). Os oócitos foram tratados em meio TL-HEPES-PVA com hialuronidase, a fim de retirar as células do cumulus. A zona pelúcida foi retirada através de lavagem dos oócitos em meio TL-HEPES-PVA com tripsina. Em seguida, os oócitos foram colocados em placas de fertilização, às quais se adicionaram os espermatozóides capacitados, permanecendo em estufa de CO2 por 3 horas a 38,5ºC, para promover a penetração. A seguir, procedeu-se à fixação e coloração dos oócitos. Foram realizados experimentos de coloração dos espermatozóides capacitados pela técnica de tripla coloração simplificada. Não houve diferença estatisticamente significativa (p >; 0,05) entre os meios utilizados, no que diz respeito à taxa de penetração dos espermatozóides capacitados, assim como entre o número de espermatozóides viáveis com reação acrossômica após a capacitação em dois diferentes meios. Assim, ambos os meios utilizados, conjugados com o período de incubação, foram eficientes na capacitação dos espermatozóides de ovinos.An in vitro zona-free hamster oocyte penetration test was utilized in 24 trials in order to evaluate the capacitation media used for ram sperm. A pool of fresh semen was collected from three crossed breed rams. Two semen drops were washed by centrifugation and incubated in high ionic strength treatment (HIS) or in a defined medium with HEPES, on heat ewe serum and heparin. After the incubation to promote capacitation, simplified triple-stain technique was used to evaluate the spontaneous acrosome reaction of the capacitated sperm. Superovulation in 96 golden hamsters was induced by PMSG and hCG. The oocytes were treated with hyaluronidase and trypsin to remove, respectively, the cumulus cells and the zona pellucida. Oocytes and capacitated sperm were incubated during 3 hours for further penetration. Then, oocytes were fixed and stained, being evaluated under phase contrast microscope. No significant statistical difference (p >; 0.05) was found between media, concerning the penetration rate of the capacitated sperm and between number of sperm viable with acrosome reaction after the capacitation treatment using two different media. It was concluded that both media utilized were effective in capacitating ram sperm

Frozen Jaguar (Panthera onca) sperm capacitation and ability to penetrate zona free hamster oocytes

Assisted reproductive technologies in endangered species, such as artificial insemination, in vitro fertilization and embryo transfer, can be viewed as one potential approach for safeguarding species. Toward this aim, the objective of this study was to evaluate the fertility of frozen jaguar (Panthera onca) sperm and Tyrod's Talp PVA capacitation medium using the hamster zona free oocyte penetration assay. Ejaculates were collected from nine animals using electroejaculation and cryopreserved. Sperm capacitation was performed by swim-up technique using Tyrod's Talp PVA medium at room temperature. Penetration was considered when the spermatozoa head decondensation was visualized within the oocyte. This assay showed 15.4% penetrations (350/2275 oocytes). Results of this study showed high sperm abnormalities, low sperm quality after cryopreservation, and low percentage of penetrations. However, the penetration results showed that the cryopreserved jaguar's semen can be used for artificial insemination, in vitro fertilization and intra cytoplasmatic sperm injection, supporting the semen bank creation for this specie.Biotecnologias reprodutivas aplicadas a espécies selvagens, como inseminação artificial, fertilização in vitro e transferência de embriões, são vistas como um potencial caminho para proteção das espécies ameaçadas de extinção. Devido a isso, o objetivo deste estudo foi avaliar a fertilidade do sêmen congelado de onças pintadas (Panthera onca) e o meio de capacitação espermática usando o ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida. Ejaculados de nove animais foram coletados por eletroejaculação e criopreservados. Para determinar a capacitação espermática foi utilizada a técnica swin-up com meio Tyrods Talp PVA a temperatura ambiente. No ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida foram considerados como oócitos penetrados aqueles que apresentaram em seu interior a cabeça do espermatozóide descondensada. O ensaio foi realizado em um total de 2275 oócitos, dos quais 350 apresentaram em seu interior a cabeça do espermatozóide descondensada, perfazendo um total de 15.4% de penetração. Os resultados deste estudo demonstraram alto índice de anormalidades espermáticas, baixa qualidade do sêmen e baixa porcentagem de penetrações. Entretanto, os resultados de penetração espermática demonstraram que sêmen congelado de onça pintada poderá ser utilizado para inseminação artificial, fertilização in vitro e injeção intracitoplasmática dando suporte para a criação de um banco de sêmen para esta espécie

Citologia aspirativa por agulha fina (CAAF), em testículo de onça pintada (Panthera onca), utilizada como ferramenta no diagnóstico de infertilidade

Several methods of testicular punch biopsy were proposed for obtaining material for histologic or cytologic evaluation, but did not received enough clinical acceptance because it was considered to be too traumatizing. The fine Needle Aspiration (FNA) is considered a useful, simple and fast method to obtain samples from tissues. Regarding the importance of FNA in wild animals, this technique was tried in captive adult jaguar (Panthera onca) aiming the evaluation and possible causes of infertility. Using a needle and disposable syringe, the testis were aspirated. The whole aspirated was smeared onto a microscope slide and stained with Diff-quick method. Semen samples were collected by electroejaculation and analyzed for pH, total volume, motility, status, total spermatozoa count and morphology. Evaluation of sperm volume, pH, motility vigor and morphology were normal. However, was found below concentration. Cytologic quantification revealed germinative cells in all testicles. Among serial types of morphological normal spermatogenesis cells, there were found theratological forms of double final spermatids. These anomalous forms of final spermatids have not been noticed yet in FNA papers. So, we concluded that FNA together with other techniques, provides a useful tool in male infertility diagnostics, mainly when related to endangered species.Técnicas de biópsia, caracterizadas pela remoção de segmentos de órgãos e tecidos para análise histopatológica, não são indicadas no auxílio diagnóstico de alterações testiculares para animais ameaçados de extinção, por não serem totalmente isentas de riscos. Neste sentido, é de grande interesse que se desenvolvam técnicas de biópsia testicular cada vez mais seguras e com o mínimo de conseqüências negativas. Com este intuito três onças pintadas (Panthera onca) foram submetidas a exames de Citologia Aspirativa por Agulha Fina (CAAF). Amostras foram obtidas através da punção aspirativa dos testículos, esfregaços foram confeccionados, corados com Panótico e analisados sob Microscopia Óptica. Simultaneamente foram realizadas coletas de sêmen para avaliação do volume, pH, concentração, motilidade, vigor e morfologia espermáticas. Quanto à avaliação espermática, os animais apresentaram valores semelhantes aos encontrados na literatura quanto ao volume, pH, motilidade, vigor e morfologia espermáticas. Quanto a concentração espermática os animais apresentaram valores abaixo dos encontrados na literatura. Nos exames de CAAF, todas as gerações de células germinativas foram identificadas, indicando espermatogênese normal em todos os animais, com exceção das espermátides finais duplas que ainda não foram relatadas como achados em punções testiculares de outras espécies, o que vem confirmar a elevada porcentagem de células teratológicas encontradas nesses animais. Desta forma, podemos concluir que a CAAF testicular é um método diagnóstico auxiliar importante na detecção de alterações testiculares em casos de sub ou infertilidade, podendo ser utilizados na rotina de investigação do trato reprodutivo masculino, quando o exame histopatológico, por ser um método altamente invasivo, é desaconselhável

Avaliação da capacidade de penetração de sêmen congelado de onça pintada (Panthera onca) em oócitos heterólogos

Assisted reproductive technologies can be viewed as one potential approach for safeguarding wild species. In this study were evaluated the fertility of captivity male jaguar (Panthera onca) and different capacitation media using the golden hamster zona free oocyte penetration assay. We used frozen/thawed semen from 3 animals housed at Bosque dos Jequitibás, Campinas/SP, to test the Percoll gradient, Swim-up and Swim-up + 1 h incubation (5% CO2 / 38°C), considering as penetration the spermatozoa head descondensation visualized within the oocyte. The results rate was greater for Percoll (26.5%) as compared to Swim-up (8.1%) (X2 = 19.93; p < 0.05). It was not observed penetration with Swim-up + 1 h incubation (5% CO2 / 38°C). It is concluded that Percoll and Swim-up are efficient methods to perform the golden hamster zona free oocyte penetration assay using frozen/thawed jaguar (Panthera onca) spermatozoa. The low rate of penetration could be related to the high rate of morphological abnormal spermatozoa observed in the samples examined.A aplicação de técnicas de reprodução assistida em espécies selvagens ameaçadas de extinção surge como método alternativo com o intuito de minimizar a diminuição da variabilidade genética das populações. Com o objetivo de determinar a fertilidade de onças pintadas (Panthera onca) mantidas em cativeiro e avaliar a eficácia dos meios de capacitação espermática, foi realizado o ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida. Para a realização do experimento, foi utilizado sêmen congelado de 3 animais do Bosque dos Jequitibás, Campinas/SP. Foram testadas 3 técnicas: Percoll, Swim-up e Swim-up + 1 hora em estufa de CO2 a 38ºC, considerando como oócitos penetrados aqueles que apresentaram no seu interior a descondensação da cabeça do espermatozóide. A média de penetrações da técnica Percoll (26,5%) foi significativamente maior comparada à técnica Swim-up (8,1%), sendo que não houve penetração utilizando a técnica Swim-up + 1 hora em estufa de CO2 a 38°C (x² = 19,93; p < 0,05). Analisando os resultados, concluímos que as técnicas Percoll e Swim-up foram eficientes para a realização do ensaio de penetração, comprovando a capacidade de penetração dos espermatozóides de onças pintadas (Panthera onca), pós-descongelamento, em oócitos de hamster livres de zona pelúcida. Porém, houve uma baixa porcentagem de penetração, a qual pode estar associada ao elevado índice de espermatozóides morfologicamente anormais. Mais estudos devem ser conduzidos com a finalidade de avaliar a fertilidade destes animais e até que ponto a variabilidade da espécie pode estar comprometida

Effect of two ram sperm capacitating media on acrosome reaction and zona-free hamster oocyte penetration test

Foram realizados 24 experimentos de penetração de espermatozóides de carneiros em oócitos zona-free de hamster com a finalidade de avaliar dois diferentes meios de capacitação espermática. Foi feito um "pool" do sêmen fresco de três carneiros mestiços, submetido à lavagem por centrifugação para retirada do plasma seminal e incubação em meio altamente iônico (HIS) ou em meio quimicamente definido acrescido de HEPES, soro de ovelha no cio e heparina, a fim de promover a capacitação dos espermatozóides. Foram utilizadas 96 hamsters fêmeas, superovuladas com os hormônios PMSG e hCG, que forneceram 3.069 oócitos, (média de 31,97 oócitos por fêmea). Os oócitos foram tratados em meio TL-HEPES-PVA com hialuronidase, a fim de retirar as células do cumulus. A zona pelúcida foi retirada através de lavagem dos oócitos em meio TL-HEPES-PVA com tripsina. Em seguida, os oócitos foram colocados em placas de fertilização, às quais se adicionaram os espermatozóides capacitados, permanecendo em estufa de CO2 por 3 horas a 38,5ºC, para promover a penetração. A seguir, procedeu-se à fixação e coloração dos oócitos. Foram realizados experimentos de coloração dos espermatozóides capacitados pela técnica de tripla coloração simplificada. Não houve diferença estatisticamente significativa (p >; 0,05) entre os meios utilizados, no que diz respeito à taxa de penetração dos espermatozóides capacitados, assim como entre o número de espermatozóides viáveis com reação acrossômica após a capacitação em dois diferentes meios. Assim, ambos os meios utilizados, conjugados com o período de incubação, foram eficientes na capacitação dos espermatozóides de ovinos

Citologia aspirativa por agulha fina (CAAF), em testículo de onça pintada (Panthera onca), utilizada como ferramenta no diagnóstico de infertilidade

Técnicas de biópsia, caracterizadas pela remoção de segmentos de órgãos e tecidos para análise histopatológica, não são indicadas no auxílio diagnóstico de alterações testiculares para animais ameaçados de extinção, por não serem totalmente isentas de riscos. Neste sentido, é de grande interesse que se desenvolvam técnicas de biópsia testicular cada vez mais seguras e com o mínimo de conseqüências negativas. Com este intuito três onças pintadas (Panthera onca) foram submetidas a exames de Citologia Aspirativa por Agulha Fina (CAAF). Amostras foram obtidas através da punção aspirativa dos testículos, esfregaços foram confeccionados, corados com Panótico e analisados sob Microscopia Óptica. Simultaneamente foram realizadas coletas de sêmen para avaliação do volume, pH, concentração, motilidade, vigor e morfologia espermáticas. Quanto à avaliação espermática, os animais apresentaram valores semelhantes aos encontrados na literatura quanto ao volume, pH, motilidade, vigor e morfologia espermáticas. Quanto a concentração espermática os animais apresentaram valores abaixo dos encontrados na literatura. Nos exames de CAAF, todas as gerações de células germinativas foram identificadas, indicando espermatogênese normal em todos os animais, com exceção das espermátides finais duplas que ainda não foram relatadas como achados em punções testiculares de outras espécies, o que vem confirmar a elevada porcentagem de células teratológicas encontradas nesses animais. Desta forma, podemos concluir que a CAAF testicular é um método diagnóstico auxiliar importante na detecção de alterações testiculares em casos de sub ou infertilidade, podendo ser utilizados na rotina de investigação do trato reprodutivo masculino, quando o exame histopatológico, por ser um método altamente invasivo, é desaconselhável