Розробка та валідація ВЕРХ/УФ-методик визначення ефавіренцу в біологічних рідинах

Efavirenz is a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor with a number of side effects manifested by psychiatric symptoms. There are cases of acute poisoning due to administration of efavirenz, including cases of suicide attempts; therefore, efavirenz may be approved as a toxic compound in forensic toxicology. Aim. To apply the MiLiChrome® A-02 HPLC-analyzer system for efavirenz quantitative determination in biological fluids and perform validation of the procedures developed.Results and discussion. Three HPLC/UV-procedures of efavirenz determination in blood and urine have been proposed. Validation of all procedures developed has been performed by such parameters as specificity, recovery, linearity, accuracy and precision in the variants of the methods of calibration curve and standard. The results of analysis have shown the absence of peaks with the retention time, which is coincident with the efavirenz retention time, on the chromatograms of blank-samples for all variants of procedures of the analyte isolation. All procedures of sample preparation show the high efficiency of efavirenz isolation both for blood and urine (at the level of 90 %). All procedures studied are characterized by the acceptable parameters of linearity, within-run and between-run accuracy and precision. Experimental part. Sample preparation of blood and urine was carried out in three ways – 1) liquid-liquid extraction with the mixture of chloroform and 2-propanol (80 : 20); 2) 2-propanol extraction and salting-out with ammonium sulfate; 3) acetonitrile extraction and salting-out with ammonium sulfate. The chromatographic conditions were as follows: the column – Ø2 × 75 mm, ProntoSIL 120-5-C18 AQ, 5 μm; temperature – 40 °С; the flow rate – 100 μl/min; Eluent A – 0.2 M LiClO4 – 0.005 M HClO4; Eluent B – acetonitrile; the elution mode – linear gradient; detection – UV, 247 nm; the volume of injection – 2 μl. Conclusions. The set of HPLC-procedures of efavirenz quantitative determination in blood and urine has been developed. Validation of the procedures developed has been performed.Эфавиренц – ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы с рядом побочных эффектов, проявляющихся психиатрическими симптомами. Описаны случаи острых отравлений при применении эфавиренца, включая попытки самоубийств, поэтому эфавиренц может быть токсикологически значимым соединением для судебной токсикологии.Цель. Применить систему ВЭЖХ-анализатора MiLiChrome® A-02 для количественного определения эфавиренца в биологических жидкостях и провести валидацию разработанных методик.Результаты и их обсуждение. Предложены три ВЭЖХ/УФ-методики определения эфавиренца в крови и моче. Валидация всех разработанных методик проведена по таким параметрам, как специфичность, степень извлечения, линейность, правильность и прецизионность в вариантах методов калибровочного графика и стандарта. Результаты анализа показали отсутствие пиков с временем удерживания, которое совпадает со временем удерживания эфавиренца, на хроматограммах blank-образцов для всех вариантов способов пробоподготовки. Все процедуры пробоподготовки показали высокую эффективность извлечения эфавиренца как для крови, так и для мочи (на уровне 90 %). Все рассмотренные методики характеризуются приемлемыми параметрами линейности, within-run и between-run правильности и прецизионности.Экспериментальная часть. Пробоподготовку крови и мочи осуществляли тремя способами: 1) жидко-жидкостная экстракция смесью хлороформа и изопропанола (80 : 20); 2) экстракция изопропанолом и высаливание аммония сульфатом; 3) экстракция ацетонитрилом и высаливание аммония сульфатом. Условия хроматографирования: колонка – Ø2 × 75 мм, ProntoSIL 120-5-C18 AQ, 5 мкм; температура – 40 °С; скорость потока – 100 мкл/мин.; элюент А – 0,2 М LiClO4 – 0,005 М HClO4; элюент Б – ацетонитрил; режим элюирования – линейный градиент; детектирование – УФ, 247 нм; объем пробы – 2 мкл.Выводы. Разработан комплекс ВЭЖХ-методик количественного определения эфавиренца в крови и моче. Проведена валидация разработанных методик.Ефавіренц – ненуклеозидний інгібітор зворотної транскриптази з рядом побічних ефектів, що проявляються психіатричними симптомами. Описані випадки гострих отруєнь при застосуванні ефавіренцу, включаючи спроби самогубств, тому ефавіренц може бути сполукою, що має токсикологічне значення для судової токсикології.Мета. Застосувати систему ВЕРХ-аналізатора MiLiChrome® A-02 для кількісного визначення ефавіренцу в біологічних рідинах і провести валідацію розроблених методик.Результати та їх обговорення. Запропоновано три ВЕРХ/УФ-методики визначення ефавіренцу в крові і сечі. Валідацію всіх розроблених методик проведено за такими параметрами, як специфічність, ступінь ізолювання, лінійність, правильність і прецизійність у варіантах методів калібрувального графіка та стандарту. Результати аналізу показали відсутність піків з часом утримування, який співпадає з часом утримування ефавіренцу, на хроматограмах blank-зразків для всіх варіантів способів пробопідготовки. Всі процедури пробопідготовки показали високу ефективність ізолювання ефавіренцу як для крові, так і для сечі (на рівні 90 %). Всі розглянуті методики характеризуються прийнятними параметрами лінійності, within-run і between-run правильності та прецизійності. Експериментальна частина. Пробопідготовку крові і сечі здійснювали трьома способами: 1) рідинно-рідинна екстракція сумішшю хлороформу та ізопропанолу (80 : 20); 2) екстракція ізопропанолом і висолювання амонію сульфатом; 3) екстракція ацетонітрилом і висолювання амонію сульфатом. Умови хроматографування: колонка – Ø2 × 75 мм, ProntoSIL 120-5-C18 AQ, 5 мкм; температура – 40 °С; швидкість потоку – 100 мкл/хв; елюент А – 0,2 М LiClO4 – 0,005 М HClO4; елюент Б – ацетонітрил; режим елюювання – лінійний градієнт; детектування – УФ, 247 нм; об’єм проби – 2 мкл.Висновки. Розроблено комплекс ВЕРХ-методик кількісного визначення ефавіренцу в крові і сечі. Проведено валідацію розроблених методик

Застосування тонкошарової хроматографії в аналізі ефавіренцу

Aim. To carry out the integrated study of visualization conditions of efavirenz on TLC-plates with aplication of standard and particular colored reagents, and the chromatographic behavior of efavirenz using standard mobile phases.Results and discussion. It has been shown that such widely used color reagents as UV-light, Erdmann reagent, Froehde reagent, Liebermann reagent, sulfuric acid, Marquis reagent, Mandelin reagent, acidified iodoplatinate solution, iodine vapor can be used for efavirenz detection on chromatographic plates. Efavirenz gives the positive detection results with reagents used in the TLC-screening of extracts from the biological material for substances of basic, acid and neutral nature. The chromatographic mobility of efavirenz has been studied in 17 solvents systems; the systems are used as standard mobile phases according to the recommendations of the International Association of Forensic Toxicologists for TLC-screening of organic compounds of acid, neutral and basic nature, and as well as in the general TLC-screening of organic substances in the Ukrainian forensic toxicological laboratories.Experimental part. The chromatographic plates Sorbfil® PTLC-IIH-UV and Merck® TLC Silica gel 60G were used as thin layers.Conclusions. The behavior of efavirenz when developing on TLC-plates with two types of a substrate (plastic and glass) and with/without a luminophor with commonly used colored reagents has been studied. The Rf values of efavirenz under chromatographing conditions in the standard solvent systems used for TLC-screening of organic compounds of acid, neutral and basic nature have been set. Received: 17.12.2019Revised: 12.01.2020Accepted: 27.02.2020Цель. Провести комплексное исследование условий визуализации эфавиренца на ТСХ-пластинах с применением стандартных и частных цветных реагентов, а также хроматографического поведения эфавиренца с использованием стандартных подвижных фаз.Результаты и их обсуждение. Показано, что для обнаружения эфавиренца на хроматографических пластинах можно использовать такие широко применяемые проявители, как УФ-свет, реактив Эрдманна, реактив Фреде, реактив Либермана, серная кислота, реактив Марки, реактив Манделина, подкисленный раствор йодоплатината, пары йода. Эфавиренц дает положительные результаты обнаружения с реактивами, используемыми в ходе ТСХ-скрининга извлечений из биологического материала на вещества основного, кислого и нейтрального характера. Хроматографическая подвижность эфавиренца исследована в 17 системах растворителей, среди которых подвижные фазы, применяемые в качестве стандартных согласно рекомендациям Международного комитета по систематическому токсикологическому анализу Международной ассоциации судебных токсикологов для ТСХ-скрининга органических веществ кислого, нейтрального и основного характера, а также в общем ТСХ-скрининге органических веществ в судебно-токсикологических лабораториях Украины.Экспериментальная часть. В качестве тонких слоев использовали пластины Sorbfil ПТСХ-ІІВ-УФ и Merck TLC Silica gel 60G.Выводы. Исследовано поведение эфавиренца при проявлении общепринятыми хромогенными реагентами на пластинах для ТСХ с двумя типами подложки (пластик и стекло) и с УФ-индикатором и без него. Установлены значения Rf эфавиренца в условиях хроматографирования в стандартных системах растворителей, используемых для ТСХ-скрининга веществ кислого, нейтрального и основного характера. Received: 17.12.2019Revised: 12.01.2020Accepted: 27.02.2020Мета. Провести комплексне дослідження умов візуалізації ефавіренцу на ТШХ-пластинах із застосуванням стандартних і окремих кольорових реагентів, а також хроматографічної поведінки ефавіренцу з використанням стандартних рухомих фаз.Результати та їх обговорення. Показано, що для виявлення ефавіренцу на хроматографічних пластинах можна використовувати такі широко відомі проявники, як УФ-світло, реактив Ердмана, реактив Фреде, реактив Лібермана, сульфатна кислота, реактив Маркі, реактив Манделіна, підкислений розчин йодоплатинату, пари йоду. Ефавіренц дає позитивні результати виявлення з реактивами, що використовують в ТШХ-скринінгу витягів з біологічного матеріалу на речовини основного, кислого і нейтрального характеру. Хроматографічну рухливість ефавіренцу досліджено в 17 системах розчинників, серед яких рухомі фази, що застосовують як стандартні згідно з рекомендаціями Міжнародного комітету з систематичного токсикологічного аналізу Міжнародної асоціації судових токсикологів для ТШХ-скринінгу органічних речовин кислого, нейтрального та основного характеру, а також у загальному ТШХ-скринінгу органічних речовин у судово-токсикологічних лабораторіях України.Експериментальна частина. Як тонкі шари використовували пластини Sorbfil ПТСХ-ІІВ-УФ та Merck TLC Silica gel 60G.Висновки. Досліджено поведінку ефавіренцу при проявленні загальноприйнятими хромогенними реагентами на пластинах для ТШХ з двома типами підложки (пластик та скло) та з УФ-індикатором і без нього. Встановлено значення Rf ефавіренцу за умов хроматографування в стандартних системах розчинників, що використовуються для ТШХ-скринінгу речовин кислого, нейтрального та основного характеру. Received: 17.12.2019Revised: 12.01.2020Accepted: 27.02.202

Efficiency of SSR and PawS markers for evaluation of genetic polymorphism among red clover (Trifolium pratense L.) cultivars

Background. Identification of crop varieties is presently one of the most important aspects due a significant annual increase in the number of newly developed cultivars. Application of molecular markers makes it possible to identify cultivars and secure protection of plant breeders’ rights. Marker techniques based on SSR loci and PawS markers were evaluated for their efficiency in revealing the DNA polymorphism in Russian red clover cultivars, and the research results are presented in this publication.Materials and Methods. The total genome DNA was extracted by a modified SDS method from 30 seedlings per each cultivar. Nine simple sequence repeats (SSR) and 4 PawS markers were used for genotyping. The basic genetic diversity parameters were measured and analyzed using the software resources GelAnalyzer 2010а, MStools v.3, and Statistica 7.0.Results and conclusion. The mean level of intervarietal DNA polymorphism in red clover was 38.6%. Cultivar-specific amplicons were obtained for 4 accessions (cvs. ‘Trifon’, ‘Topaz’, ‘Trio’ and ‘Mars’) with SSR loci RCS1307 and RCS3095. These loci were found appropriate for identification and certification of such cultivars. The tested PawS markers (individually and in combinations) proved non-informative for the analysis of intervarietal DNA polymorphism in red clover. The only primer pair PawS5+PawS16 generated reproducible PCR products, but unique amplicons were absent in the DNA profiles. The data obtained in this study may be helpful for further identification and certification of Russian red clover cultivars and promising breeding materials

Dynamical symmetry breaking in the Nambu-Jona-Lasino model with external gravitational and constant electric fields

An investigation of the Nambu-Jona-Lasino model with external constant electric and weak gravitational fields is carried out in three- and four- dimensional spacetimes. The effective potential of the composite bifermionic fields is calculated keeping terms linear in the curvature, while the electric field effect is treated exactly by means of the proper- time formalism. A rich dynamical symmetry breaking pattern, accompanied by phase transitions which are ruled, independently, by both the curvature and the electric field strength is found. Numerical simulations of the transitions are presented.Comment: 20 pages, LaTeX, 6 .ps-figures, Final version published in "Classical and Quantum Gravity

Dynamical symmetry breaking in the external gravitational and constant magnetic fields

We investigate the effects of the external gravitational and constant magnetic fields to the dynamical symmetrybreaking. As simple models of the dynamical symmetry breaking we consider the Nambu-Jona-Lasinio (NJL) model and the supersymmetric Nambu-Jona-Lasinio (SUSY NJL) model non-minimally interacting with the external gravitational field and minimally interacting with constant magnetic field. The explicit expressions for the scalar and spinor Green functions are found up to the linear terms on the spacetime curvature and exactly for a constant magnetic field. We obtain the effective potential of the above models from the Green functions in the magnetic field in curved spacetime. Calculating the effective potential numerically with the varying curvature and/or magnetic fields we show the effects of the external gravitational and magnetic fields to the phase structure of the theories. In particular, increase of the curvature in the spontaneously broken chiral symmetry phase due to the fixed magnetic field makes this phase to be less broken. On the same time strong magnetic field quickly induces chiral symmetry breaking even at the presence of fixed gravitational field within nonbroken phase.Comment: 23 pages, Latex, epic.sty and eepic.sty are use

Chiral symmetry breaking in d=3 NJL model in external gravitational and magnetic fields

The phase structure of $d=3$ Nambu-Jona-Lasinio model in curved spacetime with magnetic field is investigated in the leading order of the $1/N$-expansion and in linear curvature approximation (an external magnetic field is treated exactly). The possibility of the chiral symmetry breaking under the combined action of the external gravitational and magnetic fields is shown explicitly. At some circumstances the chiral symmetry may be restored due to the compensation of the magnetic field by the gravitational field.Comment: 7 pages, LaTe