Control of granule cell precursor proliferation in the developing cerebellum and in medulloblastoma

The cerebellum is essential for the motor control of movement and posture. Due to its apparent simplicity and geometrical arrangement, the cerebellum provides an excellent model for studying the mechanisms that control development of the central nervous system (CNS). The cerebellar cortex is formed from two distinct proliferative zones: one ventricular and one superficial called the external granule layer (EGL). Massive clonal expansion of granule cell precursors (GCPs) occur in the EGL, and ultimately generates by far the most abundant neuronal population in the CNS. In this review, I describe recent advances in understanding the control of GCP proliferation in the developing cerebellum. I also briefty review the uncontrolled GCP proliferation associated with medulloblastoma, the most common brain malignancy in children.Biomedical Reviews 2005; 16: 35-41

Scaffold proteins in mammalian MAP kinase cascades

金沢大学がん研究所がん分子細胞制御The mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, which is conserved from yeast to humans, is activated in response to a variety of extra- and intracellular stimuli, and plays key roles in multiple cellular processes, including proliferation, differentiation, and apoptosis. The MAPK pathway transmits its signal through the sequential phosphorylation of MAPK kinase kinase to MAPK kinase to MAPK. Specific and efficient activation of the MAPK cascades is crucial for proper cellular responses to stimuli. As shown in yeast, the mammalian MAPK signaling system may also employ scaffold proteins, in part, to organize the MAPK signaling components into functional MAPK modules, thereby enabling the efficient activation of specific MAPK pathways. This review article describes recent advances in the study of potential mammalian scaffold proteins that may help us understand the complex regulation, including the spatial and temporal control, of the mammalian MAPK signaling pathways

MafB protein stability is regulated by the JNK and ubiquitin-proteasome pathways

MafB is a basic leucine zipper transcription factor that plays important roles in development and differentiation processes. During osteoclastogenesis, its expression is downregulated at the transcriptional level via the JNK and p38 MAP kinase pathways. In the present study, we demonstrated that MafB protein stability is regulated by JNK and identified a phosphorylation site, Thr62. The expression of a constitutively active form of JNK (a fusion protein MKK7α1-JNK1β1) promoted the degradation of MafB in COS7 cells, and a T62A substitution significantly reduced the instability of MafB. The introduction of a four-fold (T58A/T62A/S70A/S74A) substitution in an acidic transcription-activating domain almost protected the instability resulting from the activation of JNK. Furthermore, treatment with proteasome inhibitors increased the MafB level, and a high-molecular-weight smear, characteristic of polyubiquitination, was observed in lysates from cells in which MafB, ubiquitin, and MKK7α1-JNK1β1 were co-expressed. These results suggest that phosphorylation of MafB by JNK confers susceptibility to proteasomal degradation.ArticleARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS. 494(1):94-100 (2010)journal articl

発達期小脳における足場タンパク質JSAP1の機能解析

哺乳類MAPキナーゼ(MAPK)経路の足場タンパク質は、シグナル伝達の特異性維持を規定する因子であり、MAPKの時空間的制御にも関わると考えられている。しかし、詳細については不明な点が多い。我々は、自らのグループが同定した足場タンパク質JSAP1を中心に解析を行った。研究成果は以下の通りである。1.Jsap1ノックアウト(KO)マウスは、生直後、呼吸不全のために死亡することが知られている。しかし、その分子メカニズムについては不明な点が多い。Jsap1コンディショナルKOマウスを用いた解析により、Jsap1 KOマウスの死亡は神経系の異常に起因することが強く示唆された(Neurosci. Lett. 2007)。2.PC12細胞をモデル系とした解析を行い、足場タンパク質JSAP1はN-カドヘリンを介した細胞間相互作用の制御に関与していることを見出した(Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007)。3.発達過程および成体マウスにおけるJSAP1の発現を詳細に検討し、JNK MAPKとJSAP1 mRNAは胎仔および成体マウスにおける発現パターンが極めて類似していることを見出した。またJSAP1タンパク質は、胎仔では未分化神経細胞、および小脳の外顆粒層で特に強く発現しており、成体マウス脳では、様々なニューロンやバーグマングリアで発現しているが、中でも小脳プルキンエ細胞で高発現していることを見出した(J.Neurochem. 2006)。4.免疫組織化学法による解析を行い、JSAP1タンパク質は発達期小脳の外顆粒層を形成する顆粒前駆細胞(GCP)、特に増殖を停止したGCPで強く発現していることを見出した。JSAP1-JNK MAPKシグナル伝達系によるGCPの増殖・分化制御機構を明らかにするため、生後4日目のマウスから小脳GCPを精製し、初代培養系を用いて解析した。その結果、JSAP1-JNKシグナル伝達系はGCPの増殖阻害、および分化促進に関わることが強く示唆された(投稿準備中)。Scaffold proteins of the mammalian MAP kinase (MAPK) cascades are thought to function in the spatio-temporal regulation of these pathways by organizing the signaling components into functional modules. We have examined the functions of c-Jun NH,-terminal kinase (JNK)/stress-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1), a scaffold protein that are involved in INK MAPK cascades. Our findings are summarized as follows:1) We first generated genetically engineered mice carrying a lox-P-flanked (foxed) Jsap 1 gene, and introduced the foxed Jsap 1 deletion mutant specifically into the neural lineage. The Jsap 1 conditional knockout mice showed essentially the same phenotypes as the JSAP1-null mice, suggesting that the neonatal death of Jsap 1-deficient mice is caused by defects in the nervous system (Neurosci. Lett., 2007).2) We showed that JSAP1 scaffold regulates cell-cell interactions in PC12h cells specifically in the NGF-induced signaling pathway, and does so by modulating N-cad herin (Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007) through the knock down experiments in PC12h cells.3) We also studied JSAP1 and JNK expression in mouse brains. Our results obtained by in situ hybridization and immunohistochemical analyses strongly suggested that JSAP1-JNK signaling plays important roles in developing and adult mouse brains (J. Neurothem., 2006).4) During the development of the cerebellum, massive clonal expansion of granule cell precursors (GCPs) occurs in the outer part of the external granular layer (EGL). We have provided evidence that JSAP1 and active JNK were expressed preferentially in the post-mitotic inner EGL progenitors in the developing cerebellum. Moreover, Jsap 1 deficiency resulted in increasing numbers of proliferating GCPs in mouse embryos. Besides, overexpression of JSAP1 in cultured GCPs led to increased numbers of NeuN-positive cells together with the activation of JNK. Together, these data strongly indicated that JSAP1 promotes the cell-cycle exit and differentiation of GCPs by modulating JNK activity in cerebellar development (in preparation).研究課題/領域番号:18500238, 研究期間(年度):2006-2007出典：「発達期小脳における足場タンパク質JSAP1の機能解析」研究成果報告書　課題番号18500238 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

アルツハイマー病における選択的神経細胞死機構

アルツハイマー病における痴呆の直接的原因は、選択的な神経細胞の脱落である。しかし、その神経細胞死機構に関する知見はほとんど得られていない。我々は、アルツハイマー病で観察される神経細胞死を分子レベルで明らかにすることを目的として研究を行っており、今回、細胞内情報伝達分子JNK3に特異的に結合するタンパク質の同定・分子クローニングを行った。ヒトJNK3は、1995年Mohitらによりクローニングされ、正常者脳の特定領域-アルツハイマー病において選択的神経細胞死が認められる海馬CA1や新皮質3,5層などの錐体細胞-が主な発現部位である。酵母two-hybrid法を用いて脳cDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、2個のポジテイブクローン(BP♯2,BP♯8と命名)を得た。JNK3と同様、脳で非常に高い発現を示したBP♯2に注目してさらに解析を進めた。新規蛋白タンパクBP♯2は、in vivoにおいてJNK3と特異的に結合し、JNK3の基質にもなることが明らかになった。JNK3によりリン酸化されたBP♯2は、JNK3に対する結合能を失う。またBP♯2は、SEK1(JNKキナーゼ)との結合能も有し、その結合部位はJNK3結合部位とは異なっている。さらにBP♯2は、酵母スキャフォールド蛋白STE5とアミノ酸レベルで22%の相同性を示す。以上の結果から、BP♯2はJNK3カスケードにおけるスキャフォールド蛋白として働いていると考えられる。またBP♯2/JNK3複合体は、JNK3によるBP♯2のリン酸化により解離すると推察される。The selective neuronal degeneration in Alzheimer\u27s disease (AD) has not been extensively studied, mainly due to few specific histological or molecular markers for neuronal subpopulations. Moreover, the intracellular signaling pathway involved in the neuronal degeneration remains to be analyzed. JNK3, a member of mitogen-activated protein kinase, expresses in a subset of neurons of the human nervous system. The distribution of these neurons closely matches that of AD targeted neurons. As a first step to clarify the JNK3 cascade, we have carried out yeast two-hybrid system to isolate cDNA clones of JNK3-binding proteins. One of the JNK3-binding proteins (termed BP#2) expresses exclusively in brain as JNK3. BP#2 can be a sustrate of JNK3, and the phosphorylated BP#2 no longer binds with the activated JNK3. Furthermore, we have found that BP#2 associates with not only JNK3 but also SEK1, an activator of JNK3. These results suggest that BP#2 works as a scaffold protein in the JNK3 cascade. The JNK3/BP#2 complex would dissociate through the phosphorylation of BP#2 done by JNK3.研究課題/領域番号:08680837, 研究期間(年度):1996-1997出典：「アルツハイマー病における選択的神経細胞死機構」研究成果報告書　課題番号08680837(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

哺乳動物のストレス応答MAPキナーゼ経路における足場タンパク質の解析

金沢大学がん進展制御研究所哺乳類MAPキナーゼ(MAPK)経路の足場タンパク質は、シグナル伝達の特異性維持およびMAPKの時空間的制御に関わる因子と考えられているが、詳細については不明な点が多い。本研究課題では、我々のグループが同定した足場タンパク質JSAP1、およびそのファミリーメンバーJSAP2を中心に、細胞レベル・個体レベルでの解析を行った。先ず、in vitro分化系を用いたjsap1欠損マウス胚性幹細胞の解析を行い、JSAP1は心筋発生および神経発生において重要な役割を担っていることを明らかにした(JBC, 2002; BBRC, 2005)。また、JSAP1-JNKシグナル伝達系はFAK (focal adhesion kinase)と協調的に働き、細胞移動の制御に関わることを見いだした(Oncogene, 2002; JBC, 2005)。足場タンパク質JSAP1は細胞間相互作用にも関与しており、PC12h細胞では細胞接着分子N-カドヘリンを介して制御していることを見いだした(BBRC, 2007)。免疫組織化学法とin situハイブリダイゼーション法を用いて胎仔および成体マウス脳を詳細に調べ、発達過程および成体脳におけるJSAP1-JNKシグナル伝達系の重要性を強く示唆する結果を得た(JNC, 2006)。さらに、jsap1ノックアウトマウス(KO)および小脳初代培養系を用いた解析を行い、JSAP1-JNKシグナル伝達系は小脳顆粒前駆細胞の増殖プログラムを分化プログラムに変更する役割を担っていることを見いだした。一方、jsap2 KOマウスを作製・解析し、JSAP2が発生過程において重要な役割を担っていることを明らかにした。これらの成果は、難治疾病の病因解明や治療にも繋がると期待されるものである。特に、主に小児の小脳に発生する髄芽腫は、小脳顆粒前駆細胞の異常増殖に起因すると考えられているが、その異常増殖はJSAP1-JNKシグナル伝達系の破綻によることが強く示唆された。このように、本研究成果は、悪性腫瘍などの発症機序に関する分子レベルでの理解に貢献するとともに、JSAP1-JNKシグナル伝達系を標的とした薬剤開発にも応用されるであろう。Scaffold proteins of the mammalian MAP kinase (MAPK) cascades are considered having critical roles in spatio-temporal regulation of MAPK pathways by organizing their signaling components into functional modules. We are particularly interested in the functions of these scaffold proteins, mainly c-Jun NH_2-terminal kinase (JNK)/stress-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1); a scaffold protein that participates in JNK MAPK cascades, both in vitro and in vivo. Our findings are summarized as follows :1) We first investigated the JSAP1-null ES cells. We found that the cardiomyogenesis and neurogenesis process in JSAP1-null mutants were seriously impaired, which strongly indicated that JSAP1 plays an important role in cardiomyocyte and neural development (JBC, 2002 ; BBRC, 2005).2) We also demonstrated that JSAP1 regulates cell movement in cooperation with the focal adhesion kinase (Oncogene, 2002 ; JBC 2005).3) We further showed that JSAP1 scaffold regulates cell-cell interact ions in PC12h cells specifically in the NGF-induced signaling pathway, and does so by modulating N-cadherin (BBRC, 2007) through the knock down experiments in PC12h cells.4) We also studied JSAP1 and JNK expression in mouse brains. Our results obtained by in situ hybridization and immunohistochemical analyses strongly suggested that JSAP1-JNK signaling plays important roles in developing and adult mouse brains (JNC, 2006).5) During the development of the cerebellum, massive clonal expansion of granule cell precursors (GCPs) occurs in the outer part of the external granular layer (EGL). We have provided evidence that JSAP1 and active JNK were expressed preferentially in the post-mitotic inner EGL progenitors in the developing cerebellum. Moreover, jsapl deficiency resulted in increasing numbers of proliferating GCPs in mouse embryos. Besides, overexpression of JSAP1 in cultured GCPs led to increased numbers of NeuN-positive cells together with the activation of JNK. Together, these data strongly indicated that JSAP1 promotes the cell-cycle exit and differentiation of GCPs by modulating JNK activity in cerebellar development (in preparation).研究課題/領域番号:14086205, 研究期間(年度):2002 – 2006出典：「哺乳動物のストレス応答MAPキナーゼ経路における足場タンパク質の解析」研究成果報告書　課題番号14086205（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-14086205/140862052006kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作

Role of plasma membrane localization of the scaffold protein JSAP1 during differentiation of cerebellar granule cell precursors

金沢大学がん研究所We previously reported that the scaffold protein c-Jun NH2-terminal kinase (JNK)/stress-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1) functions in cerebellar granule cell precursors (GCPs) to promote their cell-cycle exit and differentiation. In this study, we used immunocytochemistry to examine the subcellular distribution of JSAP1 in proliferating cultured GCPs. We found that when stimulated with fibroblast growth factor-2 (FGF-2), a factor that promotes GCP differentiation through JNK and extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling, JSAP1 translocated to the plasma membrane and colocalized with activated JNK and ERK. In transfected cells expressing a constitutively activated FGF receptor (FGFR), JSAP1 and the activated FGFR colocalized at the plasma membrane with not only activated but also unphosphorylated and inactive JNK and ERK. These colocalizations did not occur when a mutant JSAP1 lacking the JNK-binding domain was substituted for wild-type JSAP1. Biochemical analyses of transfected cells showed that activated FGFR increased JSAP1\u27s affinity for JNK and ERK and that JSAP1 enhanced FGFR-induced JNK and ERK activation. Collectively, these results suggest that when stimulated by FGFR, JSAP1 translocates to the plasma membrane, where it recruits JNK and ERK and facilitates their activation, leading to the differentiation of cerebellar GCPs. © 2010 The Authors. Journal compilation © 2010 by the Molecular Biology Society of Japan/Blackwell Publishing Ltd

JNKシグナル伝達経路における足場タンパク質の同定とその機能解析

MAPキナーゼ(MAPK)経路における足場タンパク質は、シグナル伝達の特異性保持に関わる重要な制御因子である。我々はJNK MARK経路の足場タンパク質として機能すると考えられる2種類のJNK結合新規タンパク質(それぞれJSAP1,JNKBP1と命名)を同定した。本研究ではさらに解析を行い、以下の研究成果が得られた。1.JSAP1,およびJNKBP1のファミリーメンバー(それぞれJSAP2,JNKBP2と命名)を新たに同定した。2.酸化ストレスにおいて重要な役割を担うASK MAPKKKとJSAP1の関係について検討し、JSAP1はASKによるリン酸化依存的にASK/JNK経路の足場タンパク質として働くことが強く示唆された。3.JSAP1の生理的機能を明らかにするためJSAP1ノックアウト(KO)マウスES細胞を作製し、in vitro分化系を用いて解析を行った。その結果、JSAP1は神経細胞への分化、および神経細胞の突起伸長等において重要な役割を担っていることが示唆された。4.JSAP1はキネシンを介して神経細胞の成長円錐に輸送されることがすでに報告されているが、変異JSAP1を用いた解析からこの輸送はJNK非依存的であることが強く示唆された。以上の研究成果に加え、今後さらに解析を進めることによりJSAP1,JSAP2,JNKBP1のin vivoにおける機能を明らかにすることができると考えられる。現在、Cre-loxP系を用いたJSAP1 KOマウス、JSAP2 KOマウス、およびJNKBP1 KOマウスの作製に取り組んでいる。また、JSAP1,JSAP2,JNKBP1によるシグナル伝達の特異性保持機構を分子レベルで理解するため、酵母2ハイブリッド法による結合タンパク質のスクリーニングも行っている。Scaffold proteins in MAP kinase(MAPK) signal transduction pathways organize MAPK signaling components into functional MAPK modules, thereby enabling the efficient and specific activation of MAPK pathways. We previously identified two novel JNK MAPK-binding proteins, termed JSAP1 and JNKBP1, which may function as scaffolding proteins in the MAPK pathways. In this research project, we have further analyzed the putative scaffold proteins, and obtained the following results. 1.We have identified family members of JSAP1 and JNKBP1,termed JSAP2 and JNKBP2,respectively. 2.We have analyzed the functional relationship between JSAP1 and ASK MAPKKK that activates JNK and p38 MAPK pathways in response to environmental stresses such as reactive oxygen species. Our data suggest that JSAP1 dynamically participates in signal transduction by forming a phosphorylation-dependent signaling complex in the ASK-JNK signaling module. 3.We established JSAP1-null mouse embryonic stem(ES) cell lines. Neurite outgrowth from the JSAP1-null embryoid bodies was apparently less efficient than from wild type. We also observed altered expression of differentiation markers, especially markers for neuroectoderm during in vitro differentiation of JSAP1-null mutant. These results suggest that JSAP1 may be required for early embryonic neurogenesis. 4.We established stable PC12h cell lines that expressed wild-type JSAP1 and its mutant lacking the JNK-binding domain(JBD). immunocytochemical studies of the cell lines indicated that the mutant JSAP1 was localized to the growth cones of differentiating PC12h cells in a similar manner to wild-type JSAP, suggesting that the proper subcellular localization of JSAP1 along microtubules probably does not require INK signaling.研究課題/領域番号:13680777, 研究期間(年度):2001-2003出典：「JNKシグナル伝達経路における足場タンパク質の同定とその機能解析」研究成果報告書　課題番号13680777 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

JNKカスケードにおける足場タンパク質の同定とその解析

金沢大学がん研究所本研究では、細胞死に深く関わるJNK MAPキナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路に注目し、特定のシグナル伝達経路の選択的活性化機構および他のシグナル伝達系とのクロストークについて解析を行った。先ず、JNK結合タンパク質として同定したJNKBP1についてMAPKKK,MAPKとの相互作用を調べたところ、JNKBP1はTAK1,MEKK1 MAPKKK,およびJNK,p38 MAPKと特異的に結合することが明らかになった。さらに、JNKBP1はTAK1(あるいはMEKK1)によるJNKの活性化を増強することも明らかになった。以上の結果から、JNKBP1はTAK1-,MEKK1-JNK系における足場タンパク質として機能しており、シグナル伝達経路の選択的活性化に関与すると考えられる。現在、p38シグナル伝達経路におけるJNKBP1の役割について検討中である。一方、MEKK1-JNK系における足場タンパク質として既に報告したJSAP1について解析したところ、JSAP1はRaf→MEK→ERKカスケードにも関与しており、その場合は抑制的に働くことを見出した。この結果は、足場タンパク質JSAP1が他のシグナル伝達系とのクロストークにおいても重要な役割を担うことを強く示唆している。ERKカスケードの活性化は、一般的に、細胞の分化(あるいは増殖)を促す。JSAP1は、このようなERKカスケードを抑制すると同時に、特定のJNKカスケードに対しては正の制御因子として働くことにより、細胞死の実行を容易にしていると考えられる。また、JSAP1におけるJNK結合部位を詳細にマッピングし、そのJNK結合部位を含むペプチド(17アミノ酸残基)がJNKのin vitroキナーゼ活性を阻害することを見出した。研究課題/領域番号:12215049, 研究期間(年度):2000出典：研究課題「JNKカスケードにおける足場タンパク質の同定とその解析」課題番号12215049（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12215049/）を加工して作