A Single-Domain Antibody Targeting Complement Component C5 Acts as a Selective Inhibitor of the Terminal Pathway of the Complement System and Thus Functionally Mimicks the C-Terminal Domain of the Staphylococcus aureus SSL7 Protein

The complement system is an efficient anti-microbial effector mechanism. On the other hand abnormal complement activation is involved in the pathogenesis of multiple inflammatory and hemolytic diseases. As general inhibition of the complement system may jeopardize patient health due to increased susceptibility to infections, the development of pathway-specific complement therapeutics has been a long-lasting goal over the last decades. In particular, pathogen mimicry has been considered as a promising approach for the design of selective anti-complement drugs. The C-terminal domain of staphylococcal superantigen-like protein 7 (SSL7), a protein secreted by Staphylococcus aureus, was recently found to be a specific inhibitor of the terminal pathway of the complement system, providing selective inhibition of cell lysis mediated by the membrane attack complex (MAC). We describe here the selection by phage display of a humanized single-domain antibody (sdAb) mimicking the C-terminal domain of SSL7. The antibody, called sdAb_E4, binds complement C5 with an affinity in the low micromolar range. Furthermore, sdAb_E4 induces selective inhibition of MAC-mediated lysis, allowing inhibition of red blood cell hemolysis and inhibition of complement deposition on apopto-necrotic cells, while maintaining efficient bactericidal activity of the complement terminal pathway. Finally, we present preliminary results indicating that sdAb_E4 may also be efficient in inhibiting hemolysis of erythrocytes from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Our data provide a proof of concept for the design of a selective MAC inhibitor capable of retaining complement bacteriolytic activity and this study opens up promising perspectives for the development of an sdAb_E4-derived therapeutics with application in the treatment of complement-mediated hemolytic disorders

Rôle du facteur d'initiation e/aIF2 dans le démarrage de la traduction chez les Eucaryotes et chez les archées.

Eukaryotic and archaeal initiation factors 2 (e/aIF2) are heterotrimeric proteins (αβγ) that supply the small ribosomal subunit with methionylated initiator tRNA, therefore insuring specific recognition of the start codon on mRNA. The structure of aIF2γfrom the archaeon P. abyssi was previously solved in our laboratory. The γsubunit, which forms the core of the heterotrimer, is a close structural homologue of bacterial elongation factor EF1A. However, it displays specific features that could account for its specific role in translation initiation. One of the main goals of this work has been to design an in vitro assay to follow the association between aIF2 and Met-tRNAi Met. This test enabled us to identify determinants of Met-tRNAi Met important for its recognition by aIF2 and to investigate the role of each subunit of aIF2 in tRNA binding. On the one hand, the methionine moiety of initiator tRNA is a crucial determinant for Met-tRNAi Met recognition by aIF2 while the other nucleotidic determinants have only a minor role. On the other hand, the γsubunit alone is able to bind Met-tRNAi Met in a manner similar to that of EF1A. But its affinity for the tRNA molecule is strongly reduced in comparison to the affinity of the intact heterotrimer. Therefore, at least one other subunit must play a role in this interaction. Indeed, the αsubunit is required to have a full tRNA binding while βhas no role in this interaction. Within the αsubunit, domain 3 binds the γsubunit via an idiosyncratic loop located in domain 2 of aIF2γ. Moreover, the αD3γ heterodimer is necessary and sufficient to have an optimal affinity for Met-tRNAi Met. In a second step, we obtained crystals of the intact aIF2αand of a truncated version of αformed of only domains 2 and 3. The structures ofαD2-3 and αwere solved at 2.26 and 3.37 Å resolution, respectively. The three-domain organisation of αis conserved in Eukarya and Archaea. Domains 1 and 2 form a rigid body which is linked to a third mobile domain. Sequence comparisons established that the most conserved regions in aIF2αlie at opposite sides of the protein, within domain 1 and domain 3. Both domains show general RNA binding properties. Thereby, domain 1 could interact with either rRNA or mRNA on the ribosome. Finally, crystals of aIF2αγfrom Sulfolobus solftaricus were obtained and the structure of the heterodimer was solved and refined to 3.0 Å resolution. This structure confirmed biochemical data previously obtained: αD3 connects domain 2 of the γsubunit via the L1 loop of γ. For the first time in an aIF2γstructure, conformation of the two switch regions of γ involved in GTP binding are similar to those encountered in the EF1A:GTP:Phe-tRNAPhe complex. Comparison with the EF1A structure suggests that only the γsubunit of the aIF2αγ heterodimer contacts tRNA. Because the αsubunit markedly reinforces the affinity of the γ subunit for tRNA, a contribution of αto the switch movements observed in the γstructure is considered.Le facteur hétérotrimérique e/aIF2 joue un rôle central dans le démarrage de la traduction chez les Eucaryotes et chez les Archées. Il conduit l'ARNt initiateur méthionylé jusqu'au ribosome et assure la spécificité de sélection du codon de démarrage sur l'ARNm. La structure cristallographique d'aIF2de l'archée Pyrococcus abyssi, précédemment résolue au laboratoire, a révélé une très forte homologie entre aIF2γ, qui constitue le coeur de l'hétérotrimère, et le facteur d'élongation bactérien EF1A. Cependant, possède des caractéristiques structurales propres qui pourraient être responsables de sa spécificité d'action dans le démarrage de la traduction. Une étape cruciale de ce travail a consisté à développer un test de suivi in vitro de l'association d'aIF2 au Met-ARNti Met. Ce test a permis d'évaluer l'importance des caractéristiques du Met-ARNti Met et la contribution de chacune des sous-unités de l'hétérotrimère dans la formation du complexe aIF2:Met-ARNti Met. Ainsi, il a été montré que le résidu méthionine constitue un déterminant majeur dans la reconnaissance du Met-ARNti Met par aIF2. D'autre part, il apparaît que la sous-unité seule est effectivement capable de lier l'ARNt selon un mode similaire à celui observé pour EF1A mais avec une affinité considérablement réduite par rapport à celle de l'hétérotrimère. Nous avons montré que la présence de la sous-unité αétait nécessaire pour retrouver une affinité optimale vis-à-vis de l'ARNt tandis que la sous-unité βne semble pas jouer de rôle dans cette liaison. L'utilisation d'une stratégie de découpage d'en domaines séparés a montré que c'est le domaine 3 d'aIF2qui lie la sous-unité par l'intermédiaire d'une boucle du domaine 2 de . De plus, le dimère D3semble nécessaire et suffisant pour retrouver une affinité pour l'ARNt comparable à celle du facteur natif. Dans un second temps, des cristaux de la sous-unité entière et d'une forme tronquée correspondant aux domaines 2 et 3 ont été obtenus. Les structures d'D2-3 et d'complet ont été résolues à respectivement 2.26 et 3.37 Å de résolution. L'analyse du modèle structural a révélé une mobilité du domaine 3 d'αpar rapport au bloc rigide formé par les domaines 1 et 2. La comparaison de séquences d'e/aIF2a montré que les zones de conservation d'se situaient principalement dans le domaine 1 et dans le domaine 3 de la protéine, qui possèdent tous les deux des propriétés générales de liaison des ARNs. Le domaine 1 d'αpourrait ainsi interagir avec un autre partenaire de type ARN du démarrage de la traduction, tel que l'ARNm ou l'ARN ribosomal. Finalement, des cristaux d'aIF2de Sulfolobus solfataricus ont été obtenus et la structure de l'hétérodimère a été résolue à 3.0 Å. Cette structure a confirmé les données biochimiques précédemment obtenues : le domaine 3 de la sous-unité interagit avec le domaine 2 de , au niveau de la boucle L1 précédemment caractérisée. L'analyse de cette structure a révélé pour la première fois une conformation des régions Switch de similaire à celle observée au sein du complexe EF1A:GDPNP:ARNt, ce qui permet d'expliquer la GTPdépendance de la fixation du Met-ARNti Met par aIF2. La comparaison de cette structure à celle d'EF1A suggère que seule γpourrait être en contact avec l'ARNt au sein de l'hétérodimère αγ. Le renforcement de l'affinité pour l'ARNt observé en présence d'αnous a conduit à envisager un rôle possible d'αdans l'établissement des conformations observées pour les régions Switch dans la structure d'aIF2γ

Un mécanisme d’activation cystéine-dépendant pour les ligands pro-inflammatoires de RAGE ?

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Rôle du facteur d'initiation e/aIF2 dans le démarrage de la traduction chez les eucaryotes et chez les archées

PALAISEAU-Polytechnique (914772301) / SudocSudocFranceF

Structural insights into S100 proteins recognition and signal transduction by the RAGE receptor

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Les CEACAM épithéliales, plateformes d’ancrage des microorganismes pathogènes dans les muqueuses

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