Maritime route of colonization of Europe

The Neolithic populations, which colonized Europe approximately 9,000 y ago, presumably migrated from Near East to Anatolia and from there to Central Europe through Thrace and the Balkans. An alternative route would have been island hopping across the Southern European coast. To test this hypothesis, we analyzed genome-wide DNA polymorphisms on populations bordering the Mediterranean coast and from Anatolia and mainland Europe. We observe a striking structure correlating genes with geography around the Mediterranean Sea with characteristic east to west clines of gene flow. Using population network analysis, we also find that the gene flow from Anatolia to Europe was through Dodecanese, Crete, and the Southern European coast, compatible with the hypothesis that a maritime coastal route was mainly used for the migration of Neolithic farmers to Europe

Safety and Efficacy of Donor T Cells Engineered with Herpes Simplex Virus Thymidine-Kinase Suicide Gene (TK Cells) Given after T-Cell Depleted (TCD) Haploidentical Hematopoietic Transplantation (Haplo-HSCT): Results of a 14-Year Follow-Up in 45 Patients

n/

Evaluation of the chromatin insulators' effect in the expression of transgenes incorporated in retroviral vectors

Πρωταρχικός στόχος αυτής της εργασίας ήταν η διερεύνηση του ρόλου των μονωτών χρωματίνης (chromatin insulators), και συγκεκριμένα του μονωτή χρωματίνης cHS4 (chicken Hypersensitive site 4), στην προστασία της έκφρασης του μεταφερόμενου γονιδίου μέσω ρετροιικών φορέων, από τις αρνητικές επιδράσεις του χρωματινικού περιβάλλοντος γύρω από τη θέση ενσωμάτωσης των φορέων. Είναι γνωστό ότι όταν γονίδια μετακινούνται από το φυσικό τους περιβάλλον, όπως στα διαγονιδιακά ζώα ή σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας, το νέο χρωμοσωμικό περιβάλλον έχει καθοριστική επίδραση και συχνά τα επίπεδα έκφρασης στη νέα θέση δεν έχουν καμμία ομοιότητα με αυτά της φυσικής τους θέσης. Αυτή η ανομοιογένεια στην έκφραση προκύπτει συνήθως λόγω γειτνίασης με έναν ενδογενή ενισχυτή ή αποσιωπητή ή αντανακλά την τοποθέτηση του γονιδίου αναφοράς κοντά σε περιοχή ανενεργού χρωματίνης. Τέτοιες επιδράσεις του χρωματινικού περιβάλλοντος μπορεί να είναι καταστροφικές για επιτυχείς εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας. Στα θηλαστικά η υπερευαίσθητη στην DNAse I περιοχή 4 από τον β γονιδιακό τόπο της όρνιθας (cHS4, chicken hypersensitive site 4), είναι η μόνη με αποδεδειγμένη δράση κλασσικού μονωτή χρωματίνης. Η δυνατότητα, ωστόσο, του cHS4 να δρα ως μονωτής χρωματίνης μετά από ενσωμάτωσή του σε ρετροιικούς φορείς και να προστατεύει την έκφραση του μεταφερόμενου γονιδίου από τα φαινόμενα θέσεως, δεν είχε μελετηθεί. Απώτερος στόχος της μελέτης, ήταν η κατασκευή ενός μονωμένου θεραπευτικού φορέα σφαιρίνης με προοπτική κλινικής χρήσης για τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Η εργασία αυτή κατέδειξε για πρώτη φορά, ότι η ενσωμάτωση του τμήματος cHS4 σε κατασκευές ρετροιικών φορέων, μπορεί να εξασφαλίσει μακροχρόνια διατήρηση της έκφρασης γονιδίων αναφοράς (neo και GFP) σε μοντέλο διαμόλυνσης-μεταμόσχευσης ποντικών (DW Emery, E.Yannaki, J.Tubb and G.Stamatoyannopoulos. A chromatin insulator protects retrovirus vectors from chromosomal position effects. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(16):9150- 9155). Κατά συνέπεια, ο μη μονωμένος φορέας MGPN2 εμφάνισε σημαντική πτώση της GFP έκφρασης στα λευκά αιμοσφαίρια 2 μήνες μετά τη μεταμόσχευση με ένα εξαιρετικά μικρό κλάσμα αποικών της μυελικής σειράς να εκφράζουν το neo γονίδιο, ενώ αντίθετα, η μόνωση του φορέα με το τμήμα cHS4 βελτίωσε σημαντικά το ποσοστό των λευκών που εξέφραζαν την LTR → GFP κασέτα καθώς και το κλάσμα των προγονικών κυττάρων που εξέφραζαν την Pgk → neo κασέτα μακροπρόθεσμα. Παρόμοια προστασία της έκφρασης του μεταφερόμενου γονιδίου δείχθηκε και με θεραπευτικό γονίδιο (γ-σφαιρίνη) στους εξαιρετικά ευαίσθητους στις επιδράσεις των φαινομένων θέσεως φορείς σφαιρινών σε μοντέλο διαμόλυνσης-μεταμόσχευσης ποντικών (DW Emery, E. Yannaki, J. Tubb, T. Nishino, Q. Li, G.Stamatoyannopoulos. Development of virus vectors for gene therapy of β chain hemoglobinopathies: flanking with a chromatin insulator reduses γ-globin gene silencing in vivo. Blood 2002; 100(6):2012-2019). Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η πλαισίωση του φορέα της γ-σφαιρίνης με τον cHS4 μονωτή χρωματίνης αύξησε την πιθανότητα έκφρασης της γ-κασσέτας σχεδόν 10 φορές (από 5.1%±7.2% σε 48.9%±19.9%) για τα κύτταρα που περιείχαν τον προιό και το ποσοστό των ερυθρών που εξέφραζαν τη γ-σφαιρίνη συνέχιζε να αυξάνει με την πάροδο του χρόνου. Αντίθετα, στον μη μονωμένο φορέα το γονίδιο της γ- σφαιρίνης ήταν αποσιωπημένο στην συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων. Πράγματι, η μόνωση που παρατηρήθηκε ήταν σημαντική και εξασφάλισε ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης γ-σφαιρίνης που θα μπορούσε δυνητικά να αποδώσει ένα θεραπευτικό όφελος σε ασθενείς με μεσογειακή αναιμία ή δρεπανοκυτταρική νόσο καθώς αυξημένα επίπεδα αιμοσφαιρίνης HbF μπορούν να μετριάσουν τη βαρύτητα των συνδρόμων αυτών και να αποδεσμεύσουν τους πάσχοντες από την ανάγκη μεταγγίσεων. Η επιτευχθείσα μόνωση ωστόσο, αν και σημαντική παραμένει ατελής, καθώς ένα ποσοστό του ενσωματωμένου προιού είναι ‘σιωπηλό’ και η παρατηρούμενη έκφραση της γ-σφαιρίνης είναι ανομοιογενής. Ο ενσωματωμένος προιός δηλαδή, εξακολουθεί να διατηρεί ακόμη κάποια ευαισθησία - αν και σαφώς ελαττωμένη - στις επιδράσεις της περιβάλλουσας χρωματίνης. Δείξαμε επίσης ότι η μόνωση δεν είναι ολοκληρωτική γιατί υπόκειται σε ισχυρούς τοπογραφικούς περιορισμούς ανάλογα με την απόσταση του μονωτή από τους αντίστοιχους υποκινητές (E. Yannaki, J. Tubb, M. Aker, G. Stamatoyannopoulos, DW Emery. Topological constraints governing the use of the chicken HS4 chromatin insulator in oncoretrovirus vectors. Molecular therapy 2002; Vol(5):589-598). Συγκεκριμένα, η μονωτική δραστηριότητα ελλαττώνεται όταν το πυρηνικό (core) στοιχείο του cHS4 τοποθετείται αμέσως δίπλα στον ενισχυτή-υποκινητή στόχο. Ειδικότερα, η τοποθέτηση του τμήματος cHS4 στην αρχή της περιοχής U3 από την 3' LTR μπορεί να μπλοκάρει την αλληλεπίδραση ανάμεσα στον 3' LTR ενισχυτή και σε εσωτερικές κασσέτες έκφρασης που μπορεί να βασίζονται σε αυτή την αλληλεπίδραση για έκφραση υψηλού επιπέδου. Επίσης, η μόνωση είναι ατελής στα πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα είτε γιατί αυξάνει η βαρύτητα των φαινομένων θέσεως ή γιατί συμβαίνει αυτόνομη αποσιώπηση των υποκινητών. Παρά το γεγονός ότι η μόνωση που προσδίδει η πλαισίωση των ρετροιικών φορέων με τον μονωτή χρωματίνης cHS4 δεν είναι πλήρης, η δυνατότητα βελτίωσης της εκτελεστικής ικανότητας των ρετροιικών φορέων που προκύπτει από την ενσωμάτωση των μονωτών χρωματίνης σε κατασκευές θεραπευτικών φορέων είναι σημαντική. Έτσι, μελέτες που ακολούθησαν από άλλους ερευνητές και έκαναν χρήση θεραπευτικών φορέων σφαιρίνης, υιοθέτησαν την ενσωμάτωση του συγκεκριμένου μονωτή στην ιική κατασκευή και έδειξαν πλήρες θεραπευτικό όφελος (Puthenveetil, G.,Blood 2004). Τα τελευταία χρόνια προτείνεται επίσης η ενσωμάτωση μονωτών χρωματίνης σε κατασκευές ιικών φορέων, και ως πρόσθετο στοιχείο ασφάλειας, καθώς η ιδιότητά τους να δρουν ως διακόπτες ενισχυτών όταν τοποθετούνται μεταξύ υποκινητή-ενισχυτή μπορεί θεωρητικά να μπλοκάρει την ενεργοποίηση ογκογονιδίων κατά την (τυχαία) ενσωμάτωση του προιού στο γονιδίωμα, ελαχιστοποιώντας έτσι τον κίνδυνο της εισχωρητικής μεταλλαξιογένεσης-ογκογένεσης. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι η πρώτη κλινική μελέτη γονιδιακής θεραπείας για τη θαλασσαιμία, που ξεκίνησε στη Γαλλία τον Σεπτέμβριο του 2006, κάνει χρήση ενός λεντιικού φορέα β- σφαιρίνης που είναι μονωμένος με το τμήμα cHS4. Η εργασία αυτή ολοκληρώθηκε πειραματικά το 2002. Ένα μέρος της εκπονήθηκε στο Medical Genetics Department του Πανεπιστημίου της Washington και το υπόλοιπο στο Εργαστήριο Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας της Αιματολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου Γ. Παπανικολάου. Η εργασία αυτή αποτέλεσε την αφετηρία για την έναρξη ενός μακρόπνοου προγράμματος Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας στο Νοσοκομείο Παπανικολάου σε συνεργασία με το Πανεπιστήμιο της Washington και τον καθηγητή George Stamatoyannopoulos. Στα χρόνια που ακολούθησαν, δημιουργήθηκε στο Νοσοκομείο Παπανικολάου, υπαγόμενη στο πλαίσιο λειτουργίας της Αιματολογικής Κλινικής- Μονάδας Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών, η πρώτη Μονάδα Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας στην Ελλάδα, σε συμμόρφωση με τα GMP (Good Manufacturing Practice) πρότυπα και παράλληλα διαμορφώθηκε και εγκρίθηκε από τις θεσμικές αρχές Ελλάδας και Αμερικής ένα κλινικό πρωτόκολλο γονιδιακής θεραπείας σε ασθενείς με μεσογειακή αναιμία που πραγματοποιείται στη Θεσσαλονίκη και ξεκίνησε τον Φεβρουάριο του 2007

Current status and developments in gene therapy for thalassemia and sickle cell disease

β-thalassemias and sickle cell anemia (SCA) are the most common monogenic diseases worldwide for which curative treatments remain a desired goal. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT), - the only curative treatment currently available for hemoglobinopaties-, has a narrow application window whereas it incurs several immunological risks. Gene therapy (GT), that is the autologous transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells (CD34+), represents a promising new therapeutic strategy which is anticipated to reestablish effective hemoglobin production and render patients transfusion- and drug- independent without the immunological complications that normally accompany allo-HCT. Prior to the application of GT for hemoglobinopathies in the clinic, many years of extensive preclinical research were spent for the optimization of the gene transfer tools and conditions. To date, three GT clinical trials for β-thalassemia and sickle cell disease (SCD) have been conducted or are in progress and 3 cases of transfusion independence in thalassemic β0/βΕ patients have been reported. In the present review, the prerequisites for successful implementation of GT, the tough pathway of GT for hemoglobinopathies towards the clinic and the knowledge gained from the first clinical trials as well as the remaining questions and challenges, will be discussed. Overall, after decades of research including achievements but pitfalls as well, the path to GT of human patients with hemoglobinopathies is currently open and highly promising..

Reinforcing the Immunocompromised Host Defense against Fungi: Progress beyond the Current State of the Art

Despite the availability of a variety of antifungal drugs, opportunistic fungal infections still remain life-threatening for immunocompromised patients, such as those undergoing allogeneic hematopoietic cell transplantation or solid organ transplantation. Suboptimal efficacy, toxicity, development of resistant variants and recurrent episodes are limitations associated with current antifungal drug therapy. Adjunctive immunotherapies reinforcing the host defense against fungi and aiding in clearance of opportunistic pathogens are continuously gaining ground in this battle. Here, we review alternative approaches for the management of fungal infections going beyond the state of the art and placing an emphasis on fungus-specific T cell immunotherapy. Harnessing the power of T cells in the form of adoptive immunotherapy represents the strenuous protagonist of the current immunotherapeutic approaches towards combating invasive fungal infections. The progress that has been made over the last years in this field and remaining challenges as well, will be discussed

In Vivo Hematopoietic Stem Cell Genome Editing: Perspectives and Limitations

The tremendous evolution of genome-editing tools in the last two decades has provided innovative and effective approaches for gene therapy of congenital and acquired diseases. Zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator- like effector nucleases (TALENs) and CRISPR-Cas9 have been already applied by ex vivo hematopoietic stem cell (HSC) gene therapy in genetic diseases (i.e., Hemoglobinopathies, Fanconi anemia and hereditary Immunodeficiencies) as well as infectious diseases (i.e., HIV), and the recent development of CRISPR-Cas9-based systems using base and prime editors as well as epigenome editors has provided safer tools for gene therapy. The ex vivo approach for gene addition or editing of HSCs, however, is complex, invasive, technically challenging, costly and not free of toxicity. In vivo gene addition or editing promise to transform gene therapy from a highly sophisticated strategy to a “user-friendly’ approach to eventually become a broadly available, highly accessible and potentially affordable treatment modality. In the present review article, based on the lessons gained by more than 3 decades of ex vivo HSC gene therapy, we discuss the concept, the tools, the progress made and the challenges to clinical translation of in vivo HSC gene editing

Pathogen-specific T Cells: Targeting Old Enemies and New Invaders in Transplantation and Beyond

Adoptive immunotherapy with virus-specific cytotoxic T cells (VSTs) has evolved over the last three decades as a strategy to rapidly restore virus-specific immunity to prevent or treat viral diseases after solid organ or allogeneic hematopoietic cell-transplantation (allo-HCT). Since the early proof-of-principle studies demonstrating that seropositive donor-derived T cells, specific for the commonest pathogens post transplantation, namely cytomegalovirus or Epstein-Barr virus (EBV) and generated by time- and labor-intensive protocols, could effectively control viral infections, major breakthroughs have then streamlined the manufacturing process of pathogen-specific T cells (pSTs), broadened the breadth of target recognition to even include novel emerging pathogens and enabled off-the-shelf administration or pathogen-naive donor pST production. We herein review the journey of evolution of adoptive immunotherapy with nonengineered, natural pSTs against infections and virus-associated malignancies in the transplant setting and briefly touch upon recent achievements using pSTs outside this context

Empowering the Potential of CAR-T Cell Immunotherapies by Epigenetic Reprogramming

T-cell-based, personalized immunotherapy can nowadays be considered the mainstream treatment for certain blood cancers, with a high potential for expanding indications. Chimeric antigen receptor T cells (CAR-Ts), an ex vivo genetically modified T-cell therapy product redirected to target an antigen of interest, have achieved unforeseen successes in patients with B-cell hematologic malignancies. Frequently, however, CAR-T cell therapies fail to provide durable responses while they have met with only limited success in treating solid cancers because unique, unaddressed challenges, including poor persistence, impaired trafficking to the tumor, and site penetration through a hostile microenvironment, impede their efficacy. Increasing evidence suggests that CAR-Ts’ in vivo performance is associated with T-cell intrinsic features that may be epigenetically altered or dysregulated. In this review, we focus on the impact of epigenetic regulation on T-cell differentiation, exhaustion, and tumor infiltration and discuss how epigenetic reprogramming may enhance CAR-Ts’ memory phenotype, trafficking, and fitness, contributing to the development of a new generation of potent CAR-T immunotherapies