Контроль качества меченых FITC белков для интерактомных исследований методами капиллярного SDS гель-электрофореза и SPR биосенсором

The technology of dye-labeled proteins has many fields of application, especially in interactomics. The aim of this work was to adapt protocol of conjugation of low molecular weight (12 – 15 kDа) heme-containing proteins with fluorescein isothiocyanate, isomer I, (FITC) for subsequent protein-protein interaction studies. We have monitored the quality of FITC-labeling of the target protein and comparative assessment of its binding capacity. Using the cytochrome C (Mw 12 kDа) as an example, it has been shown that using the three step method approach including conventional spectrophotometry, capillary gel electrophoresis and SPR analysis it is possible to assess: (i) the capability of the FITC-labeled target protein to interact with its protein partner and protein material from tissue lysates, (ii) the fact of dye conjugation with the protein, and (iii) the quality of purification for final protein preparation from unreacted free dye moleculesТехнология меченых красителем белков имеет очень много областей использования, в том числе и для интерактомных исследований. Целью данной работы была оценка применимости протокола мечения белков флуоресцеин изотиоционатом (изомер I, (FITC)) для белков с небольшой молекулярной массой (12 –15 кДа) путем их ковалентной конъюгации с FITC, а также контроль качества включения метки в белок и сравнительная оценка его способности к белок-белковым взаимодействиям. На примере цитохрома с (12 кДа) было показано, что комбинированное использование методов традиционной спектрофотометрии, капиллярного гель-электрофореза и SPR-анализа позволяет сделать выводы о: а) сохранении способности меченого целевого белка взаимодействовать с белками-партнёрами и белковым материалом тканевых лизатов; б) факте включения метки в белок; в) качестве очистки финального белкового препарата от не прореагировавших с ним свободных молекул красителя

Высокопроизводительный скрининг с помощью оптического SPR-биосенсора низкомолекулярных соединений на взаимодействие с CYP51 Candida krusei

The opportunistic fungus Candida krusei is the causative agent of nosocomial infections characterized by high mortality and development of resistance to drugs of the azole class. Therefore, develjoment of non-azole antifungal agents against resistant fungal strains is extremly important. Lanosterol 14-alpha demethylase (CYP51) is a well-known antifungal target. The optical SPR biosensor is a universal tool for screening studies in search of new drug prototypes. This paper presents the methodological aspects of high-hroughput SPR based screening of a library of low molecular weight compounds of natural origin for their interaction with C. krusei CYP51. It has been shown that when performing high-throughput screening, a researcher should pay special attention to the degree of a sensorgram curvature in the association phase. The described approaches to the analysis of high throughput screening data can be useful for researchers working with SPR biosensors from various manufacturers.Условно-патогенный гриб Candida krusei (C. krusei) является возбудителем нозокомиальных инфекций, характеризующихся высокой летальностью. В последнее время наблюдается тенденция к увеличению доли штаммов дрожжевых грибов, резистентных к препаратам класса азолов. Поэтому поиск потенциальных противогрибковых соединений неазольной природы является актуальным направлением исследований при разработке новых эффективных терапевтических средств в отношении резистентных штаммов грибов. Ланостерол 14-альфа деметилаза (CYP51) является широко известной мишенью для противогрибковых средств. Оптические SPR-биосенсоры представляют собой универсальный инструмент для скрининговых исследований, целью которых является поиск прототипов новых лекарственных соединений. В данной работе представлены методические аспекты высокопроизводительного скрининга библиотеки низкомолекулярных соединений природного происхождения, направленного на установление их взаимодействия с CYP51 C. krusei с использованием SPR-биосенсора. Как показывают результаты, при проведении высокопроизводительного скрининга особое внимание следует обращать на степень выраженности наклона сенсограммы взаимодействия в фазе ассоциации. Описанные подходы к анализу данных высокопроизводительного скрининга могут быть полезны исследователям, работающим с SPR-биосенсорами различных моделей

Особенности пробоподготовки лизатов для повышения эффективности выделения белковых партнеров целевых белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека

The aim of this work was to test modifications of the standard protocol for the sample preparation of cell/tissue lysate before performing the affinity isolation of lysate protein partners for the target protein (bait protein) which is covalently immobilized on an inert sorbent (e.g. BrCN-, SH-Sepharose 4B) or a carrier (e.g. paramagnetic nanoparticles). The series of our previous works on applying the approach to direct molecular fishing procedure with combination of affinity chromatography and LC-MS/MS analysis using a number of proteins, encoded by the genes of human chromosome 18, have shown that there are at least two problems affecting the specificity and the effectiveness of this procedure. These include: (i) redundancy of the background proteins in the eluates from an affinity sorbent (carrier) due to isolation of multiprotein complexes “labeled” with a direct protein partner which binds with a bait protein immobilized on the sorbent; (ii) low enrichment of the eluates with appropriate protein partners due to the fact that some direct protein partners in the lysate exist in stable “wild type” complexes with the bait protein itself. This means that latter group of protein partners will not be sufficiently isolated from lysate. Therefore, in order to increase the specificity and efficiency of affinity isolation of protein partners for the bait protein, we modified the standard protocol of lysate preparation and the preliminary step on dissociation of lysate protein complexes was added. Several model experiments for the choice of regeneration solution, assessment of their efficiency in the dissociation of lysate protein complexes as well as the stability and binding capacity of proteins were performed under the control of surface plasmon resonance (SPR) biosensor Biacore 3000 using HepG2 cell lysate. It was shown that acid treatment and incubation of the cell lysate for one min on ice (final lysate dilution 20 times) and subsequent neutralization (pH shift from 2.0 to 7.4) resulted in maximal dissociation of the lysate protein complexes without significant negative effects on the protein-protein interactions tested.Целью работы было экспериментальное тестирование модификации стандартного протокола пробоподготовки клеточного/ тканевого лизата перед выполнением процедуры аффинного выделения из него белков-партнеров для целевого белка (белка-наживки), иммобилизованного на инертном сорбенте или парамагнитных наночастицах. Цикл наших предыдущих работ, посвященных прямому молекулярному фишингу с сопряжением хроматографических и масс-спектрометрических методов и технологии парамагнитных наночастиц c использованием ряда белков 18-ой хромосомы человека и также других белков показал, что существуют, по крайне мере, две проблемы, влияющие на специфичность и эффективность данной процедуры: (i) избыточность фоновых белков в элюатах с аффинного сорбента, обусловленная выделением мультибелковых комплексов, меченых прямым партнером, который связывается с целевым белком на сорбенте; (ii) низкая обогащенность элюатов белками-партнерами целевой группы обусловленная тем, что та или иная часть прямых белков-партнеров в лизате находится в составе стабильных комплексов «дикого типа» с самим белком-наживкой и не будет в достаточной степени выделена из лизата. Поэтому для повышения специфичности и эффективности аффинного выделения белков-партнеров целевого белка нами предложена модификация стандартной пробоподготовки, заключающаяся в предварительной диссоциации белковых комплексов лизата. Модельные эксперименты по выбору регенерационного раствора, оценке стабильности и связывающей способности белков при его воздействии, а также оценка эффективности диссоциации комплексов в лизате были выполнены под контролем оптического биосенсора Biacore 3000 («GE Healthcare», США) с использованием лизата клеточной культуры гепатокарциномы человека (HepG2) и рекомбинантных препаратов белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека, Показано, что кислотная обработка разбавленного в 20 раз лизата с кратковременной экспозицией в течение 1 мин на льду и с последующей нейтрализацией (с рН 2.0 до рН 7.4) приводила к максимальной диссоциации белковых комплексов лизата, не оказывая существенного негативного влияния на тестируемые белок- белковые взаимодействия

Протеолипосомы как способ иммобилизации мембранных белков для SPR-анализа на примере взаимодействия CYP3A4 и CYB5A человека

Microsomal systems of human cytochrome P450 consist of three components, which are membrane proteins: cytochrome P450 hemoprotein (CYP), NADPH-dependent cytochrome P450 reductase (CPR), and a small regulatory heme-containing protein cytochrome b₅ (CYB5A). In the study of the cytochrome P450 system functioning the study of intermolecular interactions both with partner proteins and with possible drug prototypes is of great importance. Surface plasmon resonance (SPR) is a powerful and reliable tool for studying intermolecular interactions. However, there is a problem of immobilization of membrane proteins on the optical chip of the SPR biosensor. It is important to immobilize such proteins in native conditions with respect to the correct orientation of the protein globule to the surface of sensor. Previously, we have developed and described a method involving direct native immobilization of membrane proteins into a planar bilayer lipid membrane on the surface of a biosensor chip. At the same time, one of the commonly used approaches to working with membrane proteins using various methods is the construction of proteoliposomes containing membrane proteins. In this work, using CYP3A4 and CYB5A as protein partners, we evaluated two approaches to the creation of proteoliposomes: incorporation of a membrane protein into liposomes saturated with detergents and incorporation of a membrane protein into the forming proteoliposomes by the mechanism of micellar coalescence. The interaction of CYP3A4 with proteoliposomes obtained by incorporating CYB5A into detergent-saturated liposomes was shown. On the contrary, interaction between CYP3A4 and proteoliposomes containing CYB5A, obtained by the method of micellar coalescence, was not detected. Thus, it was shown that the incorporation of the membrane protein into liposomes saturated with a detergent was a more preferable method for working with an SPR biosensor as compared to the method of proteoliposomes formation by micellar coalescence. Detailed protocols for the creation of proteoliposomes and SPR-analysis can be useful to a wide range of researchers.Микросомальные системы цитохромов P450 человека состоят из трёх компонентов, являющихся мембранными белками: гемопротеина цитохрома P450 (CYP), NADPH-зависимой цитохром Р450 редуктазы (CPR) и небольшого регуляторного гем-содержащего белка цитохрома b₅ (CYB5A). Важным направлением в изучении системы цитохромов Р450 является исследование межмолекулярных взаимодействий как с белками-партнёрами, так и с возможными прототипами лекарств. Одним из передовых подходов к изучению межмолекулярных взаимодействий является использование метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR). При этом возникает проблема иммобилизации мембранных белков на оптический чип SPR-биосенсора. Для моделирования нативных условий важное значение имеет соблюдение правильной ориентации белковой глобулы в пространстве. Ранее нами был разработан метод, предполагающий прямую иммобилизацию нативных мембранных белков в планарную бислойную липидную мембрану на поверхности чипа биосенсора. Другим широко распространённым подходом для работы с мембранными белками является конструирование протеолипосом, содержащих мембранные белки. В данной работе нами на примере белковых партнёров CYP3A4 и CYB5A было проведено сравнение двух подходов создания протеолипосом для SPR-анализа межмолекулярных взаимодействий мембранных белков: встраивание мембранного белка в липосомы, насыщенные детергентом, и встраивание мембранного белка в формирующиеся протеолипосомы по механизму мицеллярной коалесценции. SPR-анализ показал взаимодействие CYP3A4 с протеолипосомами, полученными методом встраивания CYB5A в липосомы, насыщенные детергентом. Факт взаимодействия между CYP3A4 и полученными методом мицеллярной коалесценции протеолипосомами, содержащими CYB5A, зафиксировать не удалось. Полученные результаты показали, что встраивание мембранного белка в липосомы, насыщенные детергентом, является более предпочтительным методом для работы с SPR-биосенсором по сравнению с методом формирования протеолипосом мицеллярной коалесценцией. Приведенные подробные протоколы создания протеолипосом и SPR-анализа могут быть полезны широкому кругу исследователей