Сравнение результатов SPR анализа взаимодействия антиген-антитело, выполненного с помощью биосенсоров Biacore X-100 («Cytiva», США) и MI-S200D («Inter-Bio», Китай)

Limited availability of Western scientific equipment, explains a growing need to switch to using scientific instruments made in China. This is especially true in the case of optical biosensors operating on the surface plasmon resonance (SPR) effect. However, comparability of experimental data obtained using Western and Chinese biosensors has not been investigated yet. In this work we have comparedresults of SPR analysis of the kinetics and affinity of interaction of IgG2a and IgG1 antibodies with protein A. Two biosensos Biacore X-100 (“Cytiva”, USA) and MI-S200D (“Inter-Bio”, China) have been used. It was shown that the values of the association rate constants obtained on both devices for two antibodies were close within one order of magnitude. For IgG1 antibodies, the dissociation rate constants were almost identical. Both devices provide high-quality data that are well described by a simple 1:1 model (Langmuir binding).В настоящее время в связи с ограничениями доступности западного научного оборудования растет актуальность перехода на использование научных приборов, произведенных в Китае. Сказанное в полной мере относится к оптическим биосенсорам, работающим на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (SPR). При этом возникают вопросы о сопоставимости экспериментальных данных, полученных с помощью биосенсоров западного и китайского производства. В данной работе были сопоставлены результаты SPR-анализа кинетики и аффинности взаимодействия антител IgG2a и IgG1 с белком А, полученные с помощью биосенсоров Biacore X-100 («Cytiva», США) и MI-S200D («Inter-Bio», Китай). Было показало, что значения констант скорости ассоциации, полученных на обоих приборах для двух антител, близки в пределах одного порядка. Для антител IgG1 практически совпадают константы скорости диссоциации. Оба прибора дают высококачественные данные, которые хорошо описывались простой моделью 1:1 (Langmuir binding)

Моделирование гематоэнцефалического барьера с использованием культур клеток мозга крысы

Permeability of the blood-brain barrier (BBB) represents a significant problem for most promising drugs used for treating brain diseases due to its high selectivity. The neurovascular unit, which includes neurons, interneurons, astrocytes, the basal membrane, smooth muscle cells, pericytes, endothelial cells, and the extracellular matrix, forms an anatomically and functionally cohesive structure that ensures effective regulation of cerebral blood flow. In vitro modeling of the BBB is a relevant and practically significant task for studying the penetration of therapeutic agents into the brain. This study presents a BBB model consisting of endothelial cells, pericytes, and astrocytes, which partially mimics the in vivo layers of the BBB. Despite some limitations, such as incomplete matching of astrocyte location, the model demonstrates high expression of tight junction proteins and optimal TEER values of the endothelial cell monolayer, making it suitable for studying the permeability of the BBB to various substances, including drugs and nanoparticles.Проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для большинства перспективных лекарственных препаратов, предназначенных для лечения заболеваний головного мозга, является серьезным препятствием из-за его высокой селективности. Нейроваскулярная единица, включающая нейроны, интернейроны, астроциты, базальную мембрану, гладкомышечные клетки, перициты, эндотелиоциты и внеклеточный матрикс, формирует анатомически и функционально целостную структуру, обеспечивающую эффективную регуляцию церебрального кровотока. Моделирование ГЭБ in vitro – актуальная задача, имеющая высокую практическую значимость для изучения проникновения терапевтических агентов в мозг. В данной работе представлена модель ГЭБ, состоящая из эндотелиоцитов, перицитов и астроцитов, которая в определенной степени имитирует in vivo слои ГЭБ. Несмотря на некоторые ограничения, такие как неполное соответствие расположения астроцитов, модель демонстрирует высокую экспрессию белков плотных контактов и оптимальные значения TEER монослоя эндотелиоцитов, что делает её пригодной для исследования проницаемости ГЭБ для различных веществ, включая лекарственные препараты и наночастицы

MetaPASS 2024: анализ вероятных спектров биологической активности лекарственно-подобных органических соединений с учетом их биотрансформации

In the human body, pharmacological substances undergo biotransformation, therefore, during drugs development, it is necessary to take into account the biological activity spectra of their metabolites. Previously, we created the MetaPASS web application to analyze the probable spectra of biological activity of drug-like organic compounds taking into account their metabolism. Here we describe a new version of MetaPASS 2024 (https://www.way2drug.com/metapass), containing increased number of known metabolic pathways, and added procedures for searching structural similarity based on MNA and QNA descriptors and searching for compounds with the highest probability estimate for target biological activity; we have also implemented representation of the spectrum of biological activity in the form of treemaps.В организме человека фармакологические вещества подвергаются биотрансформации, поэтому при исследованиях и разработке лекарств необходимо учитывать спектры биологической активности их метаболитов. Ранее нами было создано веб-приложение MetaPASS для анализа вероятных спектров биологической активности лекарственно-подобных органических соединений с учетом их метаболизма. В данной работе приведено описание новой версии MetaPASS 2024 (https://www.way2drug.com/metapass), в которой увеличено количество известных схем метаболизма, добавлены процедуры поиска по структурному сходству на основе дескрипторов MNA и QNA и поиска соединений с наибольшей оценкой вероятности проявления целевой биологической активности, а также реализовано представление спектра биологической активности в виде цветовых карт

Влияние адъювантов на антигенные свойства пептидных конструкций из фрагментов оболочечного белка Е2 вируса гепатита С

Effectiveness of the immune response in the form of the production of specific antibodies against immunogenic peptide constructs composed of conservative fragments of the hepatitis C virus envelope protein E2 depended on the adjuvants and carriers used in their preparations. The most effective formation of specific antibodies was observed in response to the injection of peptide constructs containing B- and T-epitopes of the E2 protein conjugated with a carrier with adjuvant properties, Immunomax. Antibodies obtained in response to immunization with conjugates of peptide constructs with Immunomax bound both hepatitis C virus envelope protein E2 and the heterodimer of envelope proteins E1E2.Показано, что эффективность иммунного ответа в виде продукции специфичных антител против иммуногенных пептидных конструкций, составленных из консервативных фрагментов оболочечного белка Е2 вируса гепатита С, зависит от использованных в составе препаратов адъювантов и носителей. Наиболее эффективное образование специфичных антител отмечено в ответ на введение пептидных конструкций, содержащих В- и Т-эпитопы белка Е2, конъюгированных с носителем с адъювантными свойствами Иммуномаксом. Антитела, полученные в ответ на иммунизацию конъюгатами пептидных конструкций с Иммуномаксом, связывали оболочечный белок Е2 и гетеродимер оболочечных белков Е1Е2 вируса гепатита С

ДНК-повреждающее действие и индукция апоптоза в клетках карциномы шейки матки под воздействием новых производных фосфониевых солей

This study demonstrates that (Z)-(2-(2-hydroxy-5-chlorophenyl)-2-phenylethenyl)alkyldiphenylphosphonium chlorides exhibit high antitumour activity, comparable to that of the reference drug doxorubicin. The phosphonium salts exhibited reduced toxicity towards conditionally normal cell lines in the majority of cases. The mechanism of action of compound PP8, which contains an octyl radical at the phosphorus atom, on the model cell line M-HeLa included partial cell cycle arrest in the G1 phase, an increased generation of reactive oxygen species, and an induction of mitochondrial apoptosis. These experimental data are supported by the elevated levels of p53, p21, H2A.X and caspase-9 proteins detected by multiplex analysis. The results indicated the occurrence of double-strand DNA breaks under the influence of the studied compound. Therefore, additional structural modifications to enhance the selectivity of the studied compounds will provide a basis for the development of novel effective antitumour agents.Выявлена высокая цитотоксическая активность (Z)-(2-(2-Гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенилэтенил)алкилдифенилфосфоний хлоридов на уровне препарата сравнения доксорубицина. Протестированные фосфониевые соли в большинстве случаев оказались менее токсичными в отношении условно-нормальных клеточных линий. На примере соединения РР8, содержащего октильный радикал при атоме фосфора, показана частичная остановка клеточного цикла в фазе G1, усиленная генерация активных форм кислорода, а также индукция митохондриального апоптоза опухолевых клеток M-HeLa. Экспериментальные данные подтверждаются повышенным уровнем белков р53, р21, H2A.X и каспазы-9, обнаруженным с помощью мультиплексного анализа, и свидетельствуют о возникновении двухцепочечных разрывов ДНК в результате воздействия исследованного соединения. Таким образом, дальнейшие структурные модификации с целью повышения селективности исследуемых соединений позволят рассматривать их в качестве платформы для создания новых эффективных химиотерапевтических агентов

Способы определения индивидуальных аминокислот в биологических жидкостях

Determination of the amino acid composition of biological fluids is of great diagnostic importance. Commonly accepted methods of amino acid analysis include chromatography, electrophoresis and mass-spectrometry. However, for research purposes, to solve specific problems, it is often necessary to determine not the complete amino acid profile, but the concentration of individual amino acids. This review presents literature data analysis on methods used for determining individual amino acids in biological fluids. It is shown that amino acids can be determined by spectrophotometric, electrochemical methods, as well as using a wide range of biosensors, are the detection limit is basically comparable to chromatographic methods of analysis.Определение аминокислотного состава биологических жидкостей имеет важное диагностическое значение. К общепринятым методам анализа аминокислот относятся хроматографические, электрофоретические и масс-спектрометрические методы. Однако в исследовательских целях для решения частных задач зачастую возникает необходимость определения не полного аминокислотного профиля, а концентрации отдельных аминокислот. В настоящем обзоре представлен анализ литературных данных по методам определения индивидуальных аминокислот в биологических жидкостях. Показано, что определение аминокислот можно проводить спектрофотометрическими, электрохимическими методами, а также с использованием широкого набора биосенсоров, при этом предел обнаружения не уступает хроматографическим методам анализа

К вопросу о молекулярно-генетических механизмах взаимодействия остеобластов костной ткани с биологическими материалами при остеопластике

The article herein sets out to show the molecular and genetic mechanisms underpinning regenerative processes in bone tissue during the implantation of biological materials. The adhesion of osteoblasts to biological materials is a pivotal step in the transfer of physicochemical signals from biomaterials to osteoblasts. Initially, bone tissue cells interact with the biological material indirectly, through specific extracellular matrix proteins, especially vitronectin, fibronectin, and type I collagen. During the period preceding direct contact of osteoblasts with the implant, it is possible for blood proteins to be absorbed on the surface of the biological material in few seconds. Exactly the formation of a "protein layer" on the implants has been demonstrated to favour the adhesion of osteoblasts. The process of adhesion of osteoblasts to blood proteins is facilitated by a specific sequence, RGD, a tripeptide consisting of the amino acids Arg, Gly and Asp. This sequence is characteristic of vitronectin, fibronectin, type I collagen, osteopontin, bone sialoprotein and thrombospondin. Integrin-related signalling pathways can be categorised into two distinct types: those that are contingent on the Src-FAK complex and those that are not. It has been established that the phosphorylation of FAK at various sites can trigger multiple signalling pathways, including the PI3K/Akt/mTOR pathway, the Ras/MAPK/ERK1/2 pathway, and the p130Cas-RhoA GTPase pathway. For signalling pathways whose action is not contingent on the Src-FAK complex, integrin-linked kinase (ILK) is a pivotal regulatory factor. Among other significant cell membrane proteins, cadherins have been demonstrated to function as signal transduction molecules, contributing to the regulation of critical cellular activities. Consequently, in addition to the physical attachment of osteoblasts to biomaterials, cell adhesion leads to the activation of several signalling pathways, among which integrin- and cadherin-related signalling pathways are the most significant.В статье обсуждаются молекулярно-генетические механизмы восстановительных процессов в костной ткани при имплантации биологических материалов. Адгезия остеобластов на биологических материалах является ключевым этапом в передаче физико-химических сигналов из биоматериалов в остеобласты. Клетки костной ткани вначале взаимодействуют с биологическим материалом опосредованно, через специфические белки внеклеточного матрикса, особенно витронектин, фибронектин и коллаген I типа. В течение нескольких секунд, опережая прямой контакт остеобластов с имплантатом, белки крови могут сорбироваться на поверхности биологического материала. Именно образование «белкового слоя» на имплантатах благоприятствует адгезии остеобластов. Остеобласты соединяются с белками крови с помощью специфической последовательности RGD, трипептида Arg-Gly-Asp, характерного для витронектина, фибронектина, коллагена I типа, остеопонтина, костного сиалопротеина, тромбоспондина. Связанные с интегринами сигнальные пути могут быть разделены на два типа: сигнальные пути, зависимые от комплекса Src-FAK, и сигнальные пути, независимые от комплекса Src-FAK. Различные сайты фосфорилирования молекулы FAK могут инициировать ряд путей, включая путь PI3K/Akt/mTOR, путь Ras/MAPK/ERK1/2 и путь p130Cas-RhoA GTPаза. Для сигнальных путей, действие которых активируется вне зависимости от комплекса Src-FAK, важным регуляторным фактором является интегрин-связанная киназа (ILK). Среди других важных клеточных мембранных белков кадгерины могут также служить сигнальными молекулами трансдукции, вовлеченными в регуляцию важных клеточных активностей. Таким образом, помимо физического прикрепления остеобластов к биоматериалам клеточная адгезия приводит к активации нескольких сигнальных путей, среди которых связанные с интегринами и кадгеринами сигнальные пути являются наиболее важными

Детекция супрессора опухолей почки DUSP9 в моче здоровых доноров

The DUSP9/MKP-4 belongs to the family of bispecific protein phosphatases that negatively regulate MAP kinases (ERK, p38 and JNK). The expression of DUSP9 is significantly (20-80-fold) reduced compared to normal tissue in 95% of the studied human renal cell carcinoma samples. These and other scientific data indicate that DUSP9 is an attractive target for the use in clinical practice. However, so far, postoperative tumor biopsy samples remain the only source of clinical material in which expression of DUSP9 has been studied. This significantly limits the possibilities of using DUSP9 for clinical purposes. The purpose of this work was to find out whether it would be possible to detect DUSP9 in human urine. In the study we used human kidney carcinoma ACHN cells transfected with a vector, expressing DUSP9 and urine samples from 3 healthy volunteers. DUSP9 protein was detected by the Western blot method in precipitates obtained by centrifugation. We have shown that the DUSP9 protein is present in the pellet of the urine fraction obtained by low-speed centrifugation (10000 g). It is also present in the fraction of extracellular vesicles enriched with exosomes. The obtained result indicates that the analysis of DUSP9 expression is possible using a liquid biopsy, which, in turn, can significantly expand the applicability of this analysis for clinical purposes.DUSP9/MKP-4 принадлежит к семейству биспецифических протеинфосфатаз, негативно регулирующих MAP-киназы (ERK, p38 и JNK). Экспрессия DUSP9 значительно (20-80-кратно) снижена по сравнению c нормальной тканью в 95% исследованных образцов почечно-клеточной карциномы человека. Эти и другие научные данные указывают на то, что DUSP9 является привлекательной мишенью для использования в клинической практике. Однако до сих пор единственным источником клинического материала для исследования экспрессии DUSP9 служили постоперационные биопсийные образцы опухоли. Это значительно ограничивает возможности использования DUSP9 в клинических целях. Целью настоящей работы была оценка возможности обнаружения DUSP9 в моче человека. В работе использовали клетки карциномы почки человека ACHN, трансфицированные DUSP9-экспрессирующим вектором, и образцы мочи 3 здоровых добровольцев. DUSP9 белок детектировали, используя метод Вестерн-блота в лизатах осадков, полученных методом центрифугирования. Мы показали, что белок DUSP9 содержится в осадке фракции мочи, полученной при низкоскоростном центрифугировании (10000 g). Также он присутствует во фракции внеклеточных везикул, обогащенных экзосомами. Полученный результат свидетельствует о том, что анализ экспрессии DUSP9 возможен с помощью жидкостной биопсии. Это может существенно расширить применимость этого анализа в клинических целях

Протоколы протеомного анализа: выделение, солюбилизация белков и гидролиз белков протеазами

High-throughput studies of protein composition of biological samples have become routine and are used practically in all areas of life sciences. Modern proteomics methods allow reliable identification and quantification of thousands of proteins in a single experiment. The standard procedure for proteomic analysis includes the following steps: 1. isolation and solubilization of proteins, their hydrolysis by proteases; 2. analysis of the resulting peptides by high-performance liquid chromatography with mass spectrometric detection; 3. bioinformatics and statistical processing of the results. This paper presents protocols of the first stage of proteomic analysis, i.e. sample preparation, which are routinely used in the Laboratory of Systems Biology of the Institute of Biomedical Chemistry.Высокопроизводительные исследования белкового состава биологических образцов в настоящее время стали рутинными и используются практически во всех направлениях науки о жизни. Современные методы протеомики позволяют провести достоверную идентификацию и количественную оценку тысяч белков в одном эксперименте. Стандартная процедура протеомного анализа включает следующие стадии: 1. солюбилизация и выделение белков и их последующий гидролиз протеазами; 2. анализ образовавшихся пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием; 3. биоинформатическая и статистическая обработка результатов. В данной работе представлены протоколы первого этапа протеомного анализа – пробоподготовки, которые рутинно используются в лаборатории системной биологии Института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича

Исследование адъювантных свойств хитозана в комплексе с рекомбинантным белком F наружной мембраны и рекомбинантным анатоксином Pseudomonas aeruginosa

The aim of the study was to investigate adjuvant properties of chitosan in comparison with aluminum hydroxide during immunization with recombinant proteins of Pseudomonas aeruginosa. We used recombinant outer membrane protein F (OprF) and recombinant toxoid of P. aeruginosa, to which 0.5% chitosan preparation dissolved in glutamic acid with pH 5.0 or aluminum hydroxide gel were added. The ratios of aluminum hydroxide to protein of 3:1 and 1:1 were tested, and chitosan was added at 100 μg and 50 μg for one immunizing dose. The resulting preparations were administered to mice intraperitoneally twice with a two-week interval, and then two weeks later the animals were infected intraperitoneally with P. aeruginosa (PA-103). It was shown that double administration of the recombinant OprF protein at a dose of 25 μg and recombinant toxoid at a dose of 50 μg with both aluminum hydroxide and chitosan contributed to the development of equivalent protective properties. With the complex introduction of two recombinant proteins, an increase in protective properties was observed using both adjuvants. The possibility of using antigens without adjuvant and reducing their immunizing dose during booster immunization was investigated. It turned out that a two-fold reduction in the immunizing dose did not reduce the protective effect upon repeated administration, and in the case of chitosan, an increase in the immune response was observed during booster immunization with recombinant antigens without an adjuvant. Thus, for the recombinant proteins of P. aeruginosa, the adjuvant properties of chitosan were revealed. They are not inferior in the induction of protective properties to aluminum hydroxide.Целью исследования было изучение адъювантных свойств хитозана в сравнении с гидроксидом алюминия при иммунизации рекомбинантными белками Pseudomonas aeruginosa. В работе использовали рекомбинантный белок F наружной мембраны (OprF) и рекомбинантный анатоксин P. aeruginosa, к которым добавляли 0.5% препарат хитозана, растворенный в глутаминовой кислоте с pH 5.0 или гель гидроксида алюминия. Испытали соотношение гидроксида алюминия к белку 3:1 и 1:1, а хитозан добавляли в количестве 100 мкг и 50 мкг для одной иммунизирующей дозы. При иммунизации препараты вводили мышам внутрибрюшинно двукратно с двухнедельным интервалом, а затем через две недели животных заражали внутрибрюшинно P. aeruginosa (РА-103), подсчитывая погибших и выживших животных. Иммунизация рекомбинантным белком OprF в дозе 25 мкг и рекомбинантным анатоксином в дозе 50 мкг как с гидроксидом алюминия, так и с хитозаном, способствовала развитию равнозначных протективных свойств. При комплексном введении двух рекомбинантных белков было выявлено усиление защитных свойств с использованием обоих адъювантов. Исследовали возможность применения рекомбинантных антигенов без адъюванта и уменьшения их иммунизирующей дозы при бустерной иммунизации. Снижение иммунизирующей дозы в два раза при повторном введении не уменьшило протективный эффект, а в случае хитозана, приводило к усилению иммунного ответа при бустерной иммунизации рекомбинантными антигенами без адъюванта. Таким образом, для рекомбинантных белков P. aeruginosa выявлены адъювантные свойства хитозана, не уступающие по индукции протективных свойств гидроксиду алюминия