Structure of human RNA polymerase III

In eukaryotes, RNA Polymerase (Pol) III is specialized for the transcription of tRNAs and other short, untranslated RNAs. Pol III is a determinant of cellular growth and lifespan across eukaryotes. Upregulation of Pol III transcription is observed in cancer and causative Pol III mutations have been described in neurodevelopmental disorders and hypersensitivity to viral infection. Here, we report a cryo-EM reconstruction at 4.0 Å of human Pol III, allowing mapping and rationalization of reported genetic mutations. Mutations causing neurodevelopmental defects cluster in hotspots affecting Pol III stability and/or biogenesis, whereas mutations affecting viral sensing are located in proximity to DNA binding regions, suggesting an impairment of Pol III cytosolic viral DNA-sensing. Integrating x-ray crystallography and SAXS, we also describe the structure of the higher eukaryote specific RPC5 C-terminal extension. Surprisingly, experiments in living cells highlight a role for this module in the assembly and stability of human Pol III

DNA origami-based single-molecule forcespectroscopy elucidates RNA Polymerase IIIpre-initiation complex stability

The TATA-binding protein (TBP) and a transcription factor (TF) IIB-like factor are important constituents of all eukaryotic initiation complexes. The reason for the emergence and strict requirement of the additional initiation factor Bdp1 in the RNA polymerase (RNAP) III system, however, remained elusive. A poorly studied aspect in this context is the effect of DNA strain arising from DNA compaction and transcriptional activity on initiation complex formation. We made use of a DNA origami-based force clamp to follow the assembly of human initiation complexes in the RNAP II and RNAP III systems at the single-molecule level under piconewton forces. We demonstrate that TBP-DNA complexes are force-sensitive and TFIIB is sufficient to stabilise TBP on a strained promoter. In contrast, Bdp1 is the pivotal component that ensures stable anchoring of initiation factors, and thus the polymerase itself, in the RNAP III system. Thereby, we offer an explanation for the crucial role of Bdp1 for the high transcriptional output of RNAP III

Structural basis of RNA polymerase III transcription initiation.

RNA polymerase (Pol) III transcribes essential non-coding RNAs, including the entire pool of transfer RNAs, the 5S ribosomal RNA and the U6 spliceosomal RNA, and is often deregulated in cancer cells. The initiation of gene transcription by Pol III requires the activity of the transcription factor TFIIIB to form a transcriptionally active Pol III preinitiation complex (PIC). Here we present electron microscopy reconstructions of Pol III PICs at 3.4-4.0 Å and a reconstruction of unbound apo-Pol III at 3.1 Å. TFIIIB fully encircles the DNA and restructures Pol III. In particular, binding of the TFIIIB subunit Bdp1 rearranges the Pol III-specific subunits C37 and C34, thereby promoting DNA opening. The unwound DNA directly contacts both sides of the Pol III cleft. Topologically, the Pol III PIC resembles the Pol II PIC, whereas the Pol I PIC is more divergent. The structures presented unravel the molecular mechanisms underlying the first steps of Pol III transcription and also the general conserved mechanisms of gene transcription initiation

Regulation of septin filament formation and cholesterol production by DHCR7

Elektronenmikroskopie (EM) ist eine hervorragende Methode um die Struktur von Proteinkomplexen in ihrer nativen Umgebung zu studieren. In dieser Arbeit verwendeten wir zum einen Einzelpartikelelektronenmikroskopie und Elektronenktomographie um die Struktur von Septinfilamenten und deren Interaktion mit anderen Proteinen zu untersuchen. Zum anderen züchteten wir zweidimensionale Kristalle der Dehydrocholesterinreduktase DHCR7, um in Zukunft deren Struktur elektronenkristallographisch bestimmen zu können. Septine gehören zur Familie der GTPasen und bilden große Polymere, deren Untereinheiten aus nichtpolaren Multimeren bestehen. Die Polymere wiederum bilden Filamente, die im Knospungshals von sprossenden Hefen zu finden sind. Die Rekrutierung der Septine zum Knospungshals ist abhängig von dem Signalprotein Cdc42p und zwei seiner Effektoren, Gic1 und Gic2. Die Septinfilamente lagern sich auf der Oberfläche von Membranen an und bilden dadurch zum einen ein Gerüst und zum anderen eine Diffusionsbarriere für Proteine. Obwohl man weiß, dass Gic-Proteine direkt mit Septinen interagieren, sind die strukturellen Gegebenheiten und die Signifikanz dieser Bindung bislang unbekannt. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass Gic1 an der Bindungsfläche zwischen den Septinen Cdc10- Cdc10 bindet und dabei bis zu sechs Septin-Filamente zu einem flexiblen Septin-Gic-Komplex verbindet. Die Bindung von Cdc42p(GDP) an die ersten 29 Aminosäuren von Cdc10 induziert die Dissoziierung der Septinfilamente. Cdc42p(GppNHp) hingegen interagiert nicht mit Septinen, sondern bindet direkt an Gic1. Interessanterweise führen hohe Konzentrationen von Cdc42p(GppNHp) dabei zu einer Dissoziierung des Septin-Gic-Komplexes. Ebenso haben wir den Effekt von GTP auf die Filamente selbst untersucht. GTP ersetzt GDP in Cdc11 und verursacht eine Konformationsänderung an der Bindungsfläche von Cdc11-Cdc11 was zu einer Dissoziierung der Septinfilamente führt. Die vorliegende Studie liefert ein Modell für den durch Cdc42p, GTP und Gic1 gesteuerte Auf- und Abbaus von Septinringen während des Zellzyklus. Die Dehydrocholesterinreduktase DHCR7 reduziert im letzten Schritt der Cholesterin-Biosynthese die C7-C8-Doppelbindung von 7-Dehydrocholesterin unter Verbrauch von NADPH. Eine Fehlfunktion der DHCR7 führt beim Menschen zu dem Smith-Lemli-Opitz Syndrom (SLOS). Eine atomare Struktur der DHCR7, die es bislang nicht gibt, würde die mechanistischen Grundlagen der enzymatischen Funktion des Proteins erklären und Aufschlüsse über dessen Fehlsteuerung im Krankheitsfall geben. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich deshalb mit der Isolierung, Aufreinigung und zweidimensionalen Kristallisation der menschlichen Dehydrochlosterinreduktase-7 und deren bakteriellen Homologe aus Coxiella burnettii und Plesiocystis pacifica. Für DHCR-7 aus Coxiella burnettii konnten kleine zweidimensionale gezüchtet werden, die allerdings in Zukunft verbessert werden müssen, um sie elektronenkristallographisch zu analysieren. Um die Funktion der Reduktase in vivo zu studieren, wurde die DHCR-7-katalysierte Umwandlung von Ergosterol zu Brassicasterol mit Hilfe von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS)quantifiziert. Des Weiteren zeigte eine Lokalisationsstudie in HEK293-Zellen, dass DHCR7 neben dem ER auch im Golgi-Apparat lokalisiert ist

The connecting cilium inner scaffold provides a structural foundation that protects against retinal degeneration.

Inherited retinal degeneration due to loss of photoreceptor cells is a leading cause of human blindness. These cells possess a photosensitive outer segment linked to the cell body through the connecting cilium (CC). While structural defects of the CC have been associated with retinal degeneration, its nanoscale molecular composition, assembly, and function are barely known. Here, using expansion microscopy and electron microscopy, we reveal the molecular architecture of the CC and demonstrate that microtubules are linked together by a CC inner scaffold containing POC5, CENTRIN, and FAM161A. Dissecting CC inner scaffold assembly during photoreceptor development in mouse revealed that it acts as a structural zipper, progressively bridging microtubule doublets and straightening the CC. Furthermore, we show that Fam161a disruption in mouse leads to specific CC inner scaffold loss and triggers microtubule doublet spreading, prior to outer segment collapse and photoreceptor degeneration, suggesting a molecular mechanism for a subtype of retinitis pigmentosa

Structural basis of human separase regulation by securin and CDK1-cyclin B1

In early mitosis, the duplicated chromosomes are held together by the ring-shaped cohesin complex(1). Chromosome separation in anaphase is triggered by separase, a large cysteine endopeptidase that cleaves the cohesin subunit Scc1/Rad21(2–4). Separase is activated by degradation of its inhibitors securin(5) and cyclin B(6), but the molecular mechanisms of separase regulation are not clear. Here, we used cryogenic electron microscopy (cryoEM) to determine the structures of human separase in complex with either securin or Cdk1-cyclin B1-Cks1. In both complexes, separase is inhibited by pseudosubstrate motifs that block substrate binding at the active site and at nearby docking sites. As in Caenorhabditis elegans(7) and yeast(8), human securin harbors its own pseudosubstrate motifs. In contrast, Cdk1-cyclin B1 inhibits separase by deploying pseudosubstrate motifs from intrinsically disordered loops in separase itself. One autoinhibitory loop is oriented by Cdk1-cyclin B1 to block the active sites of both separase and Cdk1(9,10). Another autoinhibitory loop blocks substrate docking in a cleft adjacent to the separase catalytic site. A third separase loop contains a phosphoserine(6) that promotes complex assembly by binding to a conserved phosphate-binding pocket in cyclin B1. Our study reveals the diverse array of mechanisms by which securin and Cdk1-cyclin B1 bind and inhibit separase, providing the molecular basis for the robust control of chromosome segregation