Detección molecular de Streptococcus agalactiae en muestras de leche mastítica en bovinos del norte y oriente antioqueños

La mastitis bovina se define como la inflamación de la glándula mamaria, caracterizandose por producir cambios en el tejido (hinchazón, temperatura elevada, dolor, endurecimiento) y cambios físicos y químicos de la leche como decoloración, presencia de coágulos y presencia de un alto número de leucocitos. En la mayoría de las ocasiones es debida a agentes infecciosos. Es la enfermedad más común del ganado lechero y la que representa más pérdidas económicas para los productores de leche de todo el mundo. En Estados Unidos las pérdidas vaca/año se calculan en USD 200. Las malas prácticas que se dan al momento de llevar a cabo el proceso de ordeño, permiten la infección de la glándula mamaria por parte de agentes patógenos como el Streptococcus agalactiae, conocido como uno de los principales agentes etiológicos de la mastitis clínica y subclínica en los bovinos. Es altamente contagioso entre las vacas, causando una de las mayores elevaciones en el Recuentos de Células Somáticas (RCS) comparado con otros patógenos. La prueba California Mastitis Test (CMT) es el método tradicional para detectar infecciones de la glándula mamaria bovina en condiciones de campo, sin embargo, no identifica el tipo de patógeno causante de la enfermedad. La prueba para la identificación de patógenos causantes de infecciones de la glándula mamaria considerada la prueba “Gold standard”, es el cultivo in vitro de la leche. La técnica molecular Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se basa en la detección y amplificación de secuencias específicas de cualquier genoma. Los objetivos principales de esta tesis fueron realizar la identificación de la bacteria causante de mastitis Streptococcus agalactiae a través de la técnica molecular PCR a partir de muestras de leche proveniente de cuartos de hembras bovinas afectados con mastitis clínica y/o subclínica grado 3; evaluar la sensibilidad y la especificidad de la PCR para el diagnóstico de Streptococcus agalactiae confrontado con el cultivo in vitro de leche, y estimar la frecuencia del S. agalactiae diagnosticado por la técnica PCR y cultivo bacteriológico en los hatos del norte y oriente antioqueños. Se analizaron 297 muestras de leche provenientes de cuartos de hembras bovinas diagnosticados por la prueba CMT con mastitis clínica y subclínica grado 3, procedentes de 13 municipios del norte y oriente antioqueño. Se estandarizaron las técnicas de biología molecular como la extracción de ADN bacteriano a partir de leche y la PCR, obteniéndose un fragmento de 586 pb del gen 16S rRNA en las muestra positivas para la presencia de S. agalactiae. Mediante tablas de contingencia se evaluó la sensibilidad y la especificidad de la PCR en comparación con la prueba de cultivo in vitro de leche para el diagnóstico de Streptococcus agalactiae. El resultado de sensibilidad y especificidad de la PCR fue de 60% y 87.3%, respectivamente. Los resultados también indicaron que la extracción de ADN bacteriano utilizando el kit es el más acertado para procesos moleculares. Se estimó una frecuencia de Streptococcus agalactiae diagnosticado por las técnicas PCR y cultivo microbiológico de las muestras de leche y se halló una frecuencia del patógeno de 31% (92 muestras positivas) por PCR y de 38.7% (115 muestras positivas) por cultivo in vitro, en los 13 municipios donde se tomaron muestras. Se realizó una comparación de frecuencia de Chi cuadrado para analizar si existían diferencias de frecuencia del patógeno entre los municipios donde se obtuvieron las muestras. La prueba arrojó que existe diferencia estadísticamente significativa (P0.05) en la frecuencia del S. agalactiae entre los diferentes municipios, pero no se encontró diferencia estadística (P0.05) entre la frecuencia evaluada en las dos zonas geográficas (norte y oriente antioqueño).Abstract: bovine mastitis is defined as inflammation of the mammary gland, characterized by producing tissue changes (swelling, elevated temperature, pain, hardening), and physical and chemical changes such as discoloration of the milk, the presence of clots and the presence of a high number of leukocytes. In most cases it is due to infectious agents. It is the most common disease of dairy cattle and representing more economic losses for dairy producers worldwide. In the US cow / year losses estimated at USD 200. The bad practices that occur when conducting the milking process, allow mammary gland infection by pathogens such as Streptococcus agalactiae, known as a major etiologic agents of clinical and subclinical mastitis in cattle. It is highly contagious among cows, causing one of the highest elevations in Somatic Cell Counts (SCC) compared to other pathogens. California Mastitis Test Test (CMT) is the traditional method to detect infections of the bovine mammary gland under field conditions, however, does not identify the type of pathogen causing the disease. The test for the identification of pathogens causing infections of the mammary gland is considered the "gold standard" test is the in vitro culture of milk. The molecular technique Polymerase Chain Reaction (PCR) is based on the detection and amplification of specific sequences of any genome. The main objectives of this thesis were performed to identify the causative bacterium Streptococcus agalactiae mastitis through PCR molecular technique from milk samples from affected quarters of female cattle with clinical and / or subclinical mastitis grade 3; I evaluate the sensitivity and specificity of PCR for the diagnosis of Streptococcus agalactiae confronted with in vitro culture of milk, and estimate the frequency of S. agalactiae diagnosed by PCR technique and bacteriological culture herds in northern and eastern Antioquia. 297 milk samples from female cattle quarters of the CMT test diagnosed with clinical and subclinical mastitis grade 3, from 13 municipalities in northern and eastern Antioquia were analyzed. Molecular biology techniques were standardized as bacterial DNA extraction from milk and PCR, yielding a 586 bp fragment of the 16S rRNA gene in the positive sample for the presence of S. agalactiae. By contingency tables sensitivity and specificity of PCR compared with culture in vitro test milk for the diagnosis of Streptococcus agalactiae was evaluated. The results of sensitivity and specificity of the PCR was 60% and 87.3%, respectively. The results also indicated that the extraction of bacterial DNA using the kit is the most successful for molecular processes. Streptococcus agalactiae frequency diagnosed by PCR techniques and microbiological culture of milk samples pathogen and a frequency of 31% (92 positive samples) by PCR and 38.7% (115 positive samples) was found by in vitro culture was estimated in the 13 municipalities where samples were taken. A comparison of frequency of Chi square was used to analyze whether there were differences between the frequency of pathogen 13 municipalities where the samples were obtained. The test showed that there is statistically significant difference (P 0.05) in the frequency of S. agalactiae among the different municipalities, but no statistical difference (P found 0.05) between the frequency evaluated in the two geographical areas (northern and eastern Antioquia).Maestrí

Diagnóstico molecular, citogenético y anatomohistopatológico del Síndrome Freemartin en hembras bovinas en Colombia

Freemartin syndrome is a intersexuality condition developed in many of the female calfs born from heterosexual multiple calvings (male female). This originates in the fetal development between 30 and 40 days of gestation with transplacental exchange of cells through vascular anastomosis, occurring 60XX/XY chimerism in various tissues, and consequent sterility. In this paper was took blood samples from 106 female calves born from a multiple heterosexual calving. DNA was extracted from leucocytes and searched the SRY gene amplification associated with the Y chromosome by PCR and reading in agarose gel. 90 of 106 samples (84.9%) was amplified the SRY gene, verifying the 60XX/XY chimerism, and 16 samples (15.1%) that did not amplify the gene. Cytogenetic analysis using lymphocytes cell cultures showed the presence of Y chromosome in samples positive for SRY and absence of chimerism in SRY negative samples. The postmortem analysis of female reproductive tracts of SRY positive calves, shows anatomical abnormalities such as clitoris hypertrophia and cervical atresia. Histological examination of gonads of these animals confirmed the presence of ovotestis. This study confirms the usefulness of molecular biology techniques as diagnostic tools of the syndrome, for the use of replacement females in cattle.El síndrome Freemartin es un estado de intersexualidad de muchas de las hembras bovinas provenientes de parto múltiple heterosexual (macho - hembra). Éste se origina en la vida fetal entre los 30 y 40 días de gestación producto del intercambio transplacentario de células mediante anastomosis vasculares, presentándose fenómenos de quimerismo 60XX/XY en varios tejidos, y esterilidad consecuente. En el presente trabajo se tomaron 106 muestras de sangre de terneras provenientes de parto múltiple heterosexual, se realizó extracción de ADN de leucocitos y se buscó la amplificación del gen SRY asociado al cromosoma "Y" mediante PCR y lectura en gel de agarosa. 90 terneras (84.9%) de las 106 amplificaron SRY, verificando el quimerismo 60XX/XY, y 16 terneras (15.1%) que no amplificaron el gen, libres del síndrome quimérico y por lo tanto, aptas reproductivamente. El análisis citogenético realizado mediante cultivo de linfocitos demostró la presencia del cromosoma "Y" en linfocitos de hembras positivas a SRY y la ausencia del quimerismo en hembras SRY negativas. El análisis anatómico post mortem de tractos reproductivos de hembras positivas a SRY detectó anormalidades características del síndrome tales como, clítoris hipertrofiados y atresias ductales cervicales. El análisis histopatológico de placas de gónadas de estos animales evidenció la presencia de ovotestículos. El presente estudio confirma la utilidad de las técnicas de biología molecular como herramientas diagnósticas del síndrome, para el aprovechamiento de hembras de reemplazo al servicio del hato bovino

Molecular, cytogenetic and anatomohistopatologic diagnostic of freemartin syndrome on females cattle in

Freemartin syndrome is a intersexuality condition developed in many of the female calfs born from heterosexual multiple calvings (male female). This originates in the fetal development between 30 and 40 days of gestation with transplacental exchange of cells through vascular anastomosis, occurring 60XX/XY chimerism in various tissues, and consequent sterility. In this paper was took blood samples from 106 female calves born from a multiple heterosexual calving. DNA was extracted from leucocytes and searched the SRY gene amplification associated with the Y chromosome by PCR and reading in agarose gel. 90 of 106 samples (84.9%) was amplified the SRY gene, verifying the 60XX/XY chimerism, and 16 samples (15.1%) that did not amplify the gene. Cytogenetic analysis using lymphocytes cell cultures showed the presence of Y chromosome in samples positive for SRY and absence of chimerism in SRY negative samples. The postmortem analysis of female reproductive tracts of SRY positive calves, shows anatomical abnormalities such as clitoris hypertrophia and cervical atresia. Histological examination of gonads of these animals confirmed the presence of ovotestis. This study confirms the usefulness of molecular biology techniques as diagnostic tools of the syndrome, for the use of replacement females in cattle

Diagnóstico molecular, citogenético y anatomohistopatológico del Síndrome Freemartin en hembras bovinas en Colombia

El síndrome Freemartin es un estado de intersexualidad de muchas de las hembras bovinas provenientes de parto múltiple heterosexual (macho – hembra). Éste se origina en la vida fetal entre los 30 y 40 días de gestación producto del intercambio transplacentario de células mediante anastomosis vasculares, presentándose fenómenos de quimerismo 60XX/XY en varios tejidos, y esterilidad consecuente. En el presente trabajo se tomaron 106 muestras de sangre de terneras provenientes de parto múltiple heterosexual, se realizó extracción de ADN de leucocitos y se buscó la amplificación del gen SRY asociado al cromosoma “Y” mediante PCR y lectura en gel de agarosa. 90 terneras (84.9%) de las 106 amplificaron SRY, verificando el quimerismo 60XX/XY, y 16 terneras (15.1%) que no amplificaron el gen, libres del síndrome quimérico y por lo tanto, aptas reproductivamente. El análisis citogenético realizado mediante cultivo de linfocitos demostró la presencia del cromosoma “Y” en linfocitos de hembras positivas a SRY y la ausencia del quimerismo en hembras SRY negativas.  El análisis anatómico post mortem de tractos reproductivos de hembras positivas a SRY detectó anormalidades características del síndrome tales como, clítoris hipertrofiados y atresias ductales cervicales.  El análisis histopatológico de placas de gónadas de estos animales evidenció la presencia de ovotestículos. El presente estudio confirma la utilidad de las técnicas de biología molecular como herramientas diagnósticas del síndrome, para el aprovechamiento de hembras de reemplazo al servicio del hato bovino.Palabras clave: cariotipo, genotipificación, intersexualidad, quimerismo, SRY.Freemartin syndrome is a intersexuality condition developed in many of the female calfs born from heterosexual multiple calvings (male female). This originates in the fetal development between 30 and 40 days of gestation with transplacental exchange of cells through vascular anastomosis, occurring 60XX/XY chimerism in various tissues, and consequent sterility. In this paper was took blood samples from 106 female calves born from a multiple heterosexual calving. DNA was extracted from leucocytes and searched the SRY gene amplification associated with the Y chromosome by PCR and reading in agarose gel. 90 of 106 samples (84.9%) was amplified the SRY gene, verifying the 60XX/XY chimerism, and 16 samples (15.1%) that did not amplify the gene. Cytogenetic analysis using lymphocytes cell cultures showed the presence of Y chromosome in samples positive for SRY and absence of chimerism in SRY negative samples. The postmortem analysis of female reproductive tracts of SRY positive calves, shows anatomical abnormalities such as clitoris hypertrophia and cervical atresia. Histological examination of gonads of these animals confirmed the presence of ovotestis. This study confirms the usefulness of molecular biology techniques as diagnostic tools of the syndrome, for the use of replacement females in cattle.Keywords: Cariotype; chimerism; intersexuality; genotypification; SRY