Development of a barley reference material for gluten analysis

Celiac disease (CD) can be triggered in susceptible individuals by the consumption of gluten, a complex storage protein mixture present in wheat, rye and barley. There is no specific reference material (RM) available for barley and this leads to inaccurate quantitation of barley gluten in supposedly gluten-free foods. Therefore, the aim was to select representative barley cultivars to establish a new barley RM. The relative protein composition of the 35 barley cultivars averaged 25% albumins and globulins, 11% d-hordeins, 19% C-hordeins, and 45% B/γ-hordeins. The mean gluten and protein content was 7.2 g/100 g and 11.2 g/100 g, respectively. The prolamin/glutelin ratio (1:1) commonly used in ELISAs to calculate the gluten content was found to be inappropriate for barley (1.6 ± 0.6). Eight cultivars suitable as potential RMs were selected to ensure a typical barley protein composition and improve food safety for CD patients

Classics in a new perspective: gluten as a special food safety and analytical challenge

In the last couple of decades, the nutritional role and perception of gluten became controversial. In one hand, gluten proteins play a central role in determining the baking quality of wheat and other cereals. On the other hand, hypersensitivity reactions triggered by gluten in susceptible individuals have become subjects of growing interest. Of these gluten-related disorders, with an estimated global prevalence of 1%, the most important one is celiac disease (CD), which is an autoimmune disorder accompanied by villous atrophy. CD can manifest in a wide range of symptoms, its only treatment option is a lifelong gluten-free (GF) diet. To support compliance to this diet, current EU legislation maximizes the gluten-content of products sold with a GF label in 20 mg/kg. It necessitates accurate quantification of gluten in this low concentration range. The method-of-choice for this purpose is the immunoanalytical-based ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). However, validation of different ELISA methods and the comparability of their results and, consequently, the reliability of the data they provide is problematic. The major goal of this paper is to introduce the analytical and protein chemistry issues behind this problem and the efforts to improve the conditions of the methodology. We are also including the special role of oats in the GF diet in an attempt to provide the widest possible overview of the food safety and analytical challenges represented by gluten

Klasszikus témák új megvilágításban: a glutén mint speciális élelmiszerbiztonsági és analitikai kihívás

A glutén, vagy sikér fehérjék táplálkozás-élettani szerepe és megítélése az utóbbi évtizedekben kettőssé vált. A glutén fehérjék egyrészt központi szerepet töltenek be a búza és más gabonák sütőipari minőségének kialakításában. Másrészt azonban egyre inkább előtérbe kerülnek olyan túlérzékenységi reakciók, melyeket szintén a glutén fehérjék váltanak ki az arra érzékeny populációban. A glutén által okozott rendellenességek közül 1% körüli globális előfordulásával az egyik legjelentősebb a lisztérzékenység, vagy más néven cöliákia, mely a vékonybél bolyhainak sorvadásával járó autoimmun betegség. A tünetek széles skáláját okozhatja, jelenleg egyetlen ismert kezelési módja az élethosszig tartó gluténmentes diéta. A diéta betartásának elősegítésére a jelenleg érvényes EU szabályozás 20 mg/kg-ban maximalizálja a gluténmentesként értékesíthető termékek gluténtartalmát. Ez pedig szükségessé teszi a glutén mennyiségének minél pontosabb meghatározását ebben az alacsony koncentráció-tartományban. A meghatározás rutinmódszere az immunanalitikai elven működő ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). A különböző ELISA módszerek validálása és eredményeik összehasonlíthatósága, vagyis az általuk szolgáltatott adatok megbízhatósága azonban problémát jelent. Cikkünk fő célkitűzése az ennek hátterében álló analitikai és fehérjekémiai kérdések, valamint a módszertan feltételrendszerének javítását célzó törekvések bemutatása. Emellett kitérünk a zab gluténmentes diétában betöltött különleges szerepére is, így kísérelve meg minél szélesebb körben rálátást nyújtani a glutén által képviselt élelmiszerbiztonsági és analitikai kihívásokra

Rye and barley reference materials for the analysis of gluten

Gluten-free foods are subject to the Codex Alimentarius as well as the Commission Implementing Regulation (EU) No. 828/2014. It is stated that gluten-free labelled foods must not exceed 20 mg/kg of gluten in the final product. To ensure food safety for celiac disease patients, accurate quantification of gluten in gluten-containing and potentially contaminated foods is crucial. Immunological methods such as the R5 ELISA are the main methods for gluten quantification that are used by food producers, as they are certified. However, there are many disadvantages of the method, due to differences in materials used for calibration and specificity of antibodies. The differences in the protein structure of different grain species (wheat, rye and barley) leads to under- or overestimation of the gluten content of rye- or barley-contaminated foods. The reason for this is the use of wheat-based calibration standards. There is a lack of standardized gluten reference materials and harmonized analytical methods in gluten analysis. Moreover, there is only little research on rye and barley proteins in general but as well as gluten reference materials from rye and barley. The objective of this study is to establish representative rye- and barley-based reference materials for gluten analysis. For this purpose, suitable cultivars were selected and various protein isolates were produced from their flour mixtures. By characterizing 32 different rye and 35 different barley cultivars using RP-HPLC, GP-HPLC and two commercially available ELISA kits (R5 and G12), we were able to identify representative cultivars for the lab-scale production of new reference materials. In terms of protein distribution, rye cultivars showed an average composition of 40% albumins/globulins, 23% γ-75k-secalins, 17% γ-40k-secalins, 14% ω-secalins and 6% high-molecular-weight-secalins. The relative protein composition of the 35 barley cultivars averaged 25% albumins and globulins, 11% D-hordeins, 19% C-hordeins and 45% B/γ-hordeins. Moreover, we discovered that the commonly used prolamin/glutelin ratio of 1:1 for calculating gluten content was unsuitable for both rye and barley. For rye, a ratio of 4.4:1 was determined, while for barley, a ratio of 1.6:1 was observed, indicating a higher proportion of prolamins compared to glutelins. The gluten content in the majority of samples was overestimated when using both ELISA kits. Additionally, we discovered that separating rye and barley gluten protein types into prolamins and glutelins using the modified Osborne fractionation was not straightforward. Of the 32 rye and 35 barley varieties, seven and eight varieties suitable for the production of the reference materials were selected using statistical tools such as hierachical cluster analysis, respectively. The gluten composition of the chosen cultivars were compared in two different harvest years. Moreover, four different protein isolates were produced using a mixture of the selected cultivars: prolamin, glutelin, total gluten and an acetonitrile water extractable protein (AWEP). The isolates were characterized using LC-MS/MS and their reactivity towards the R5 monoclonal antibody in the sandwich ELISA system was tested. For rye isolates, the reactivity order towards the R5 monoclonal antibody was as follows: prolamins>AWEP >gluten>glutelins. For barley isolates, the reactivity was highest for AWEP and prolamins, followed by gluten and glutelins. The results show that the use of the wheat-based PWG-gliadin standard in ELISA test systems does not lead to an optimal determination of the gluten content in rye and barley flours. Rye and barley reference materials are necessary to optimize gluten analysis in rye- and barley-contaminated foods. The isolates produced in this study represent one possibility for such reference materials to improve gluten quantification of barley- and rye-contaminated foods and to ensure food safety for celiac disease patients

Klasszikus témák új megvilágításban: a glutén mint speciális élelmiszerbiztonsági és analitikai kihívás

A glutén, vagy sikér fehérjék táplálkozás-élettani szerepe és megítélése az utóbbi évtizedekben kettőssé vált. A glutén fehérjék egyrészt központi szerepet töltenek be a búza és más gabonák sütőipari minőségének kialakításában. Másrészt azonban egyre inkább előtérbe kerülnek olyan túlérzékenységi reakciók, melyeket szintén a glutén fehérjék váltanak ki az arra érzékeny populációban. A glutén által okozott rendellenességek közül 1% körüli globális előfordulásával az egyik legjelentősebb a lisztérzékenység, vagy más néven cöliákia, mely a vékonybél bolyhainak sorvadásával járó autoimmun betegség. A tünetek széles skáláját okozhatja, jelenleg egyetlen ismert kezelési módja az élethosszig tartó gluténmentes diéta. A diéta betartásának elősegítésére a jelenleg érvényes EU szabályozás 20 mg/kg-ban maximalizálja a gluténmentesként értékesíthető termékek gluténtartalmát. Ez pedig szükségessé teszi a glutén mennyiségének minél pontosabb meghatározását ebben az alacsony koncentráció-tartományban. A meghatározás rutinmódszere az immunanalitikai elven működő ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). A különböző ELISA módszerek validálása és eredményeik összehasonlíthatósága, vagyis az általuk szolgáltatott adatok megbízhatósága azonban problémát jelent. Cikkünk fő célkitűzése az ennek hátterében álló analitikai és fehérjekémiai kérdések, valamint a módszertan feltételrendszerének javítását célzó törekvések bemutatása. Emellett kitérünk a zab gluténmentes diétában betöltött különleges szerepére is, így kísérelve meg minél szélesebb körben rálátást nyújtani a glutén által képviselt élelmiszerbiztonsági és analitikai kihívásokra

Classics in a new perspective: gluten as a special food safety and analytical challenge

In the last couple of decades, the nutritional role and perception of gluten became controversial. In one hand, gluten proteins play a central role in determining the baking quality of wheat and other cereals. On the other hand, hypersensitivity reactions triggered by gluten in susceptible individuals have become subjects of growing interest. Of these gluten-related disorders, with an estimated global prevalence of 1%, the most important one is celiac disease (CD), which is an autoimmune disorder accompanied by villous atrophy. CD can manifest in a wide range of symptoms, its only treatment option is a lifelong gluten-free (GF) diet. To support compliance to this diet, current EU legislation maximizes the gluten-content of products sold with a GF label in 20 mg/kg.It necessitates accurate quantification of gluten in this low concentration range. The method-of-choice for this purpose is the immunoanalytical-based ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). However, validation of different ELISA methods and the comparability of their results and, consequently, the reliability of the data they provide is problematic. The major goal of this paper is to introduce the analytical and protein chemistry issues behind this problem and the efforts to improve the conditions of the methodology. We are also including the special role of oats in the GF diet in an attempt to provide the widest possible overview of the food safety and analytical challenges represented by gluten