Identifizierung und Charakterisierung neuer Spleißvarianten des Tetraspanins CD9

Diese Arbeit beschreibt die Identifikation und initiale Charakterisierung von bisher unbekannten alternativen Transkripten des Tetraspanins CD9, das als Adaptorprotein in der Zellmembran an der Regulation fundamentaler Prozesse wie Zellproliferation, -migration und -adhäsion beteiligt ist und auch den Phänotyp maligner Zellen verschiedener Art wesentlich mitbestimmt. Obwohl keine Spleißvarianten des sehr gut untersuchten CD9 beschrieben worden waren, gab es einige Hinweise auf eine Heterogentität des Proteins, die Ausgangspunkt der Untersuchungen waren. Erste Arbeiten an malignen neuralen Rattenzelllinien, die CD9-Immunreaktivität nicht mit allen anti-CD9-Antikörpern zeigten, führten zur Identifizierung zweier CD9-Transkripte (rCD9 mRNA-B und -C), die anstelle der bekannten mRNA (rCD9 mRNA-A) transkribiert werden. Beide Transkripte enthalten im Vergleich zur rCD9 mRNA-A ein alternatives Exon 1, aber nur die Variante rCD9-C besitzt durch die alternative Sequenz ein potentielles Translationinitiationscodon, dessen Funktionalität durch Expression eines Fusionsproteins mit verstärkt grün fluoreszierendem Protein (EGFP) am C-terminalen Ende experimentell bestätigt werden konnte. Als weiterer Hinweis auf eine mögliche physiologische Bedeutung der translatierbaren Variante rCD9-C kann der Nachweis ihrer Expression in verschiedenen normalen Rattenorganen gewertet werden. Modellrechnungen ergaben, dass diese Variante neben den für Tetraspanine typischen vier Membrandomänen vermutlich eine weitere enthält, wodurch sich eine besondere Struktur mit einem in den extrazellulären Raum ragenden N-Terminus ergibt. Um auch von menschlichen Zellen exprimierte alternative CD9-Transkripte zu identifizieren, erfolgte eine systematische Suche in Sequenzdatenbanken nach auffälligen „Expressed Sequence Tags“ (EST)-Sequenzen. Ausgehend von neun Kandidatensequenzen konnte schließlich die Existenz von vier alternativen CD9-Transkripten (huCD9-2, huCD9-PT-2, huCD9 4b-1 und huCD-7b/7c) bestätigt werden. Diese enthalten ein durchgehendes Leseraster, das nach Translation zu einem funktionellen Protein führen könnte. Berechnungen zur Membrantopologie der Varianten ergaben, dass die alternative CD9 Variante-2 tetraspanintypisch vier, die anderen CD9-Spleißvarianten nur zwei (huCD9-7b/7c), drei (huCD9-4b-1) oder fünf (huCD9-PT-2) Transmembrandomänen (TM) besitzen sollten. Besonderheit der in allen untersuchten Geweben vorkommenden Variante 2 ist eine durch das alternative Exon 3.5 verlängerte intrazelluläre Schleife zwischen TM2 und TM3. Mit fünf Transmembrandomänen ähnelt die Variante PT-2 der Rattenvariante rCD9-C. Das alternative Exon 1.5 führt bei dieser Variante zu einer zusätzlichen intrazellulären Schleife und einer Verlagerung des N-Terminus in den extrazellulären Raum. Interessant ist die ausgeprägte gewebespezifische Expression dieser Variante in adultem Gehirn, Hinterstrangganglien und Ovar, was spezielle Funktionen vermuten lässt. Bei den Varianten huCD9-4b-1 und huCD9-7b/7c kommt es durch ein verlängertes Exon 6 bzw. Exon 3 mit frühem Stopp-Codon nicht zur Ausbildung der zweiten extrazellulären Schleife. Ihre auffälligsten strukturellen Besonderheiten sind die langen C-terminalen Enden. Während der C-Terminus des huCD9-7b/7c tetraspanintypisch in den intrazellulären Raum ragt, müsste er bei huCD9-4b-1 nach den Modellrechnungen extrazellulär lokalisiert sein. Diese beiden Varianten kommen in den meisten der untersuchten menschlichen Geweben und Mammakarzinom-abgeleiteten Zelllinien vor, nicht aber in Plazenta- und gesundem Brustgewebe. Angesichts der grundsätzlichen strukturellen Unterschiede der neu identifizierten CD9-Varianten ist davon auszugehen, dass Proteine dieser Art sich von der bisher bekannten CD9-Form hinsichtlich der Assoziation mit Partnermolekülen sowie der Beeinflussung intrazellulärer Signalwege wesentlich unterscheiden. Obwohl ein experimenteller Nachweis noch aussteht, erscheint plausibel, dass die durch CD9 wesentlich mitbestimmte veränderte Adhäsion und Migration maligner Zellen auch in unterschiedlichen Anteilen der verschiedenen Varianten zum Ausdruck kommt. Es ist zu erwarten, dass die weitere Charakterisierung der neu identifizierten CD9-Transkripte zu einer differenzierteren und möglicherweise erweiterten Sicht der durch CD9 mitregulierten fundamentalen physiologischen Prozesse und ihrer Fehlsteuerung bei malignen und anderen wichtigen Erkrankungen führt

Identification of alternative transcripts of rat CD9 expressed by tumorigenic neural cell lines and in normal tissues

CD9 is the best-studied member of the tetraspanin family of transmembrane proteins. It is involved in various fundamental cellular processes and its altered expression is a characteristic of malignant cells of different origins. Despite numerous investigations confirming its fundamental role, the heterogeneity of CD9 or other tetraspanin proteins was considered only to be caused by posttranslational modification, rather than alternative splicing. Here we describe the first identification of CD9 transcript variants expressed by cell lines derived from fetal rat brain cells. Variant mRNA-B lacks a potential translation initiation codon in the alternative exon 1 and seems to be characteristic of the tumorigenic BT cell lines. In contrast, variant mRNA-C can be translated from a functional initiation codon located in its extended exon 2, and substantial amounts of this form detected in various tissues suggest a contribution to CD9 functions. From the alternative sequence of variant C, a different membrane topology ( 5 transmembrane domains) and a deviating spectrum of functions can be expected