Systemy hydrożelowe modyfikowane oligonukleotydami jako potencjalne nośniki leków

W niniejszej pracy doktorskiej podjęłam się zadania stworzenia systemów uwalniania leków opartych na hydrożelach zmodyfikowanych materiałem genetycznym w różnych formach. Bezpośrednim celem pracy była dokładana analiza fizykochemiczna zsyntezowanych nośników oraz zbadanie akumulacji i uwalniania wybranego leku przeciwnowotworowego. W swojej pracy zsyntezowałam makrożele oraz nanożele. Ze względu na korzystniejsze cechy nośników w skali nano, większa część mojej pracy skupia się właśnie na nanohydrożelach. W badaniach wykorzystano zjawisko objętościowego przejścia fazowego i jego zmianę pod wpływem dodatku oligonukleotydów. Istotne było uwalnianie leku w warunkach fizjologicznych. Badane były również zmiany zachodzące w niciach DNA przyłączonych do matrycy polimerowej pod wpływem zmiennych warunków środowiskowych. Zsyntezowałam nanożele o przedłużonym uwalnianiu substancji, nanożele degradowalne pod wpływem temperatury oraz nanożele multiresponsywne, czułe na glutation. Praca zawiera dokładną doświadczalną i teoretyczną analizę procesu uwalniania leku z otrzymanych matryc polimerowych. Rozprawa rozpoczyna się wstępem oraz celem badań, następnie występuje część literaturowa. W rozdziale drugim zawarłam wprowadzenie w tematykę nośników leków oraz przedstawiłam pokrótce różne rodzaje nośników leków opisane w literaturze. W rozdziale trzecim przybliżyłam definicję oraz charakterystykę objętościowego przejścia fazowego hydrożeli polimerowych ze szczególnym uwzględnieniem hydrożeli czułych na bodźce zewnętrzne. Przestawiłam również dokładną analizę hydrożeli czułych na temperaturę, pH oraz substancje biologicznie aktywne takie jak: glukoza, enzymy czy glutation. Na koniec skupiłam się na opisaniu dotychczasowych prac przedstawiających modyfikację hydrożeli molekułą DNA. W rozdziale czwartym przybliżyłam dokładnie tematykę hydrożeli w skali nano oraz przedstawiłam ich zalety w stosunku do ich makro odpowiedników. W tej części pracy skupiłam się również na teoretycznym opisie najczęściej stosowanych metod syntezy oraz modyfikacji nanożeli materiałem biologicznym. W rozdziale piątym opisałam rolę DNA w systemach kontrolowanego uwalniania leków. Została tutaj dokładnie opisana budowa cząsteczki kwasu nukleinowego, czynniki wpływające na zmiany jego struktury oraz oddziaływania z lekami antracyklinowymi. Opisałam również różne metody detekcji DNA ze szczególnym naciskiem na omówienie metod elektrochemicznych. Część eksperymentalna składa się z pięciu rozdziałów. Na początku znajduje się szczegółowy opis oraz charakterystyka wykorzystanych w pracy odczynników i aparatury. Następnie opisałam dość szczegółowo techniki badawcze stosowane przeze mnie w pracy doświadczalnej. W rozdziale ósmym opisałam początkowe etapy mojej pracy badawczej związanej z modyfikacją hydrożeli biomolekułą DNA w skali makro. Przedstawiłam tutaj dokładnie proces syntezy oraz oczyszczania hydrożeli z niekowalencyjnie związanym natywnym DNA. Zbadana została wydajność wprowadzania podwójnych oraz pojedynczych nici DNA do sieci oraz morfologia powstałych matryc. Ważnym etapem w tej części pracy była dokładna analiza zmian zachodzących w DNA wprowadzonego do hydrożelu za pomocą metod elektrochemicznych. Udowodniono, że techniki elektrochemiczne pozwalają na bezpośrednie monitorowanie lokalnych zmian strukturalnych w DNA związanych z rozluźnianiem nici i zmianą konformacji. Ważnym krokiem było monitorowanie zmian utleniania zasad azotowych w DNA obecnych w hydrożelu w zależności od temperatury. Końcowym efektem pracy była analiza akumulacji i uwalniania leku pod wpływem bodźca temperaturowego. Podstawową ideą tego typu nośników było wykorzystanie nici DNA obecnej w hydrożelu jako rezerwuaru leku zakumulowanego na drodze interkalacji. Wyniki uzyskane w tej części pracy stały się podstawą do utworzenia bardziej złożonych układów i zminiaturyzowania nośników tworząc nanożele polimerowe. Rozdział dziewiąty jest obszerny, ponieważ zawiera większość moich wyników eksperymentalnych. W tym rozdziale skupiłam się na syntezie nanożeli na bazie monomeru NIPA oraz kwasu akrylowego. Nanożele były zmodyfikowane różnymi formami DNA. Materiał genetyczny w tym przypadku był włączany do sieci za pomocą wiązań kowalencyjnych pomiędzy ugrupowaniami obecnymi w nanożelu a odpowiednio zmodyfikowanymi (grupy akrylowe, ugrupowanie PEG2000) odcinkami DNA. Rozdział ten składa się z trzech podrozdziałów opisujących trzy niezależne rodzaje nanożeli zmodyfikowane oligonukleotydami w różny sposób. Pierwszy podrozdział dotyczy nanożeli sieciowanych standardowym środkiem sieciującym BIS i modyfikowanych hybrydą DNA składającą się z dwóch odcinków przyłączonych do sieci i trzeciego komplementarnego w połowie do dwóch obecnych już w sieci. Synteza była prowadzona dwuetapowo. Przed wyborem konkretnych sekwencji nici DNA zostały przeprowadzone symulacje, które określiły prawdopodobieństwo hybrydyzacji. Ważnym etapem w tym rozdziale była dokładna analiza parametrów fizykochemicznych nanożeli oraz zbadanie ich morfologii. Przeprowadzona została również dokładana analiza wydajności wprowadzenia DNA oraz jego hybrydyzacji; wykorzystano tu metody spektroskopowe oraz elektrochemiczne. Najważniejszym etapem badań, pod kątem aplikacyjnego zastosowania tego typu nanożeli, była analiza akumulacji i uwalniania leku przeciwnowotworowego. Wykazano, że tego typu układy charakteryzują się przedłużonym w czasie uwalnianiem substancji leczniczej. Badania komórkowe wykazały natomiast dobrą biokompatybilność nośników oraz wysoką skuteczność niszczenia komórek nowotworowych linii Hella i Insulinoma. W podrozdziale drugim skupiłam się na syntezie nanożelu, który byłby degradowany pod wpływem wysokiej temperatury. Zsyntezowałam nanożele usieciowane jedynie trzysegmentową hybrydą DNA. Do syntezy zostały użyte te same sekwencje oligonukleotydów, co w poprzednim projekcie, jednak cały proces syntezy był jednoetapowy. W tej sekcji została przedstawiona dokładnie synteza, morfologia oraz dokładna analiza parametrów fizykochemicznych uzyskanych nanożeli. Został również przenalizowany proces temperaturowej degradacji sieci spowodowany denaturacją trzysegmentowej hybrydy wbudowanej w sieć hydrożelu. Wykazano dwie drogi uwalniania leku w temperaturze 45 °C oraz 70 °C. Dodatkowo udowodniono, że zmiana środowiska reakcji na lekko kwaśne (charakterystyczne dla tkanek nowotworowych) ma również wpływ na ilość uwalnianego leku. Przeprowadzone badania komórkowe wykazały, że zarówno nanożele jak i produkty ich temperaturowej degradacji były bezpieczne dla komórek organizmu. Natomiast testy cytotoksyczności naładowanych doksorubicyną nośników wykazały wysoką skuteczność niszczenia komórek nowotworowych linii Insulinoma. Ostatni podrozdział przedstawiał nieco inną koncepcję. Skupiłam się tutaj na syntezie nanożeli czułych na kilka rodzajów bodźców jednocześnie. Zostały zsyntezowane nanożele modyfikowane kowalencyjnie odcinkami DNA zawierającymi w swojej strukturze mostki disiarczkowe. Zastosowanie tego typu oligonukleotydów uwrażliwiało dodatkowo cząstki nanożelu na obecność silnych środków redukujących takich jak glutation. Pod wpływem glutationu następowało rozszczepienie nici DNA z jednoczesnym uwolnieniem leku. Przeprowadzone w tej części badania potwierdziły dynamiczną reorganizację struktury DNA w syntezowanym nanożelu oraz utworzenie otoczki oligonukleotydowej na rdzeniu polimerowym. Wykazano, że procesy zachodzące w nanożelach są pomocne w skutecznym i kontrolowanym uwalnianiu leku oraz częściowej dezintegracji nanożelu. Współdziałanie zmian konformacyjnych rozluźniających strukturę DNA pod wpływem temperatury oraz redukacji grup disiarczkowych skutkowało zwiększoną wydajnością podczas pulsacyjnego uwalniania leku i zwiększonym uwalnianiem leku w komórkach nowotworowych. Przeprowadzone badania komórkowe dają nadzieje, że dzięki obecności nanohydrożelowego nośnika zminimalizowane zostaną negatywne efekty wiązania doksorubicyny przez białka osocza. Niewątpliwie zwiększyła się skuteczność niszczenia komórek nowotworowych linii Insulinoma. W rozdziale dziesiątym zostały przedstawione końcowe wnioski pracy doktorskiej i potwierdzenie skuteczności zsyntezowanych nośników pod kątem zaawansowanych terapii przeciwnowotworowych. W pracy przedstawiony został również spis publikacji powstałych podczas realizacji mojej pracy doktorskiej. Natomiast w końcowym rozdziale przedstawiłam literaturę, z której korzystałam podczas pisania niniejszej rozprawy.In my doctoral thesis, I undertook the task of creating drug release systems based on hydrogels modified with various forms of genetic material. The main goal of these investigations was the thorough physicochemical analysis of the synthesized materials and the study of the accumulation and release of the anticancer drug. In my work, I synthesized macrogels and nanogels. Due to the more favorable features of nanoscale carriers, most of my work was focused on this issue. The research was directed mainly to the analysis of the phenomenon of the gel volume-phase-transition and its changes caused by addition of oligonucleotides. The context was the drug release under physiological conditions. I also studied where the changes occurred in the DNA attached to the polymer matrix under the changing environmental conditions. The incorporation of various types of oligonucleotides into the polymer network resulted in a change in the properties of the nanoparticles. I synthesized nanogels that were characterized by prolonged release of substances, nanogels that were degradable under the influence of temperature, and multi-responsive nanogels sensitive to glutathione. The work presents an accurate experimental and theoretical analysis of the drug release process from the polymer matrices. The dissertation begins with the introduction and the aim of the research. Then there is a literature section. In the second chapter, I placed an introduction to the subject of the drug carriers and presented briefly various types of drug carriers described in the literature. In the third chapter the definition, characteristics, and analysis of the volume phase transition of the polymer hydrogels is given. A particular emphasis is put on the sensitive hydrogels. I provided a precise analysis of temperature-sensitive hydrogels, pH-sensitive hydrogels, and biologically-active-substances sensitive hydrogels; such substances as glucose, enzymes and glutathione. In the end, I focused on the previous works dealing with the modification of hydrogels with DNA molecules. In the fourth chapter, I took up the topic of nanoscale hydrogels and presented their advantages in relation to the macroscale equivalents. In this part of the work, I focused on the description of the most commonly used methods of synthesis and modification of nanogels with biological material. In the fifth chapter, I described the role of DNA in controlled-drug-release systems. The structure of the nucleic acid molecule, factors influencing the changes in its structure and interactions with anthracycline drugs were described in detail. I also described various methods of DNA detection with particular emphasis on the electrochemical methods. The experimental section consists of five chapters. At the beginning, there is a detailed description and characteristics of the reagents and equipment used in the work. Then, I described in detail the research techniques uses by me in the experimental work. In the eighth chapter, I presented the initial stages of my research work related to the modification of hydrogels on the macro scale with a DNA biomolecule. I presented there the process of synthesis and purification of the hydrogels with non-covalently bound native DNA. The efficiency of introducing double- and single strands of DNA on the network as well as the morphology of the resulting matrices was examined. An important step in this part of the work was a thorough analysis of the changes taking place in the DNA molecules introduced into the hydrogel by using the electrochemical methods. It was proved that the electrochemical techniques allowed direct monitoring of local structural changes in DNA associated with the loosening- and the change of conformation of the thread. An important step was to monitor the oxidation of nitrogen bases in the DNA present in the hydrogel in function of temperature. The final result of the investigation was the analysis of drug accumulation and drug release under the influence of temperature stimulus. The basic idea of this type of drug carriers was the use of the DNA strand present in the hydrogel as a reservoir of drug that was accumulated through intercalation. The results obtained in this part of PhD thesis became the basis for the creation of more complex systems and the miniaturization of the carriers. Chapter nineth is quite extensive and constitutes the majority of my experimental results. In this chapter, I focused on the synthesis of nanogels based on NIPA and acrylic acid monomer and modified with various forms of DNA. The genetic material, in this case, was incorporated into the network by means of covalent bonds between the groups present in the nanogel and the correspondingly modified (by acrylic groups or by PEG2000 groups) DNA sections. This chapter consists of three subchapters describing three independent types of oligonucleotide-modified nanogels. The first section of the chapter describes the nanogels crosslinked with the standard BIS crosslinker and modified with a DNA hybrid. The hybrid consisted of two strands connected to the network, while the third strand was complementary in half to those two already present in the network. The synthesis was carried out in two steps. Before selecting particular DNA sequences for the modification, the simulations, which determined the probability of the hybridization process, were carried out. An important point in this chapter was a thorough analysis of the physicochemical parameters of the nanogels and the study of their morphology. A thorough analysis of the efficiency of DNA incorporation and hybridization using spectroscopic and electrochemical methods was also carried out. The most important stage of this research was the analysis of the accumulation and the release of the anticancer drug. It was found, that those systems were characterized by a sustained release of the drug substance. Additionally, the cellular tests demonstrated good biocompatibility of the nanocarriers and high efficiency of destruction of the tumor cells of the Hella and Insulinoma lines. In the second section of this chapter, I focused on the synthesis of nanogels that would be degraded under the influence of high temperature. I synthesized nanogels cross-linked only with a three-segment hybrid of DNA. The same oligonucleotide sequences for the synthesis as in the previous project were used, but the whole synthesis process was one-step. The exact synthesis steps, morphology and accurate analysis of the physical-chemical parameters of the obtained nanogels were presented. The process of thermal degradation of the network due to the denaturation of the three-segment hybrid embedded in the hydrogel network as well as the reversible changes in DNA associated with the conformational changes were also analyzed. Two ways of drug release took place at 45 and 70 °C. In addition, it was demonstrated that a slight change in the acidity of the environment also affected the amount of drug released. The conducted cell research showed that both nanogels and their degradation products were safe for the body cells. Contrary, the cytotoxicity tests of doxorubicin-loaded carriers demonstrated a high destruction of the cancer cells from the Insulinoma cell line. The last section in the eight chapter presents a slightly different concept. I focused on the synthesis of nanogels sensitive to several types of stimuli at the same time. The nanogels covalently modified by DNA sections that contained the disulfide bridges were synthesized. The use of this type of oligonucleotides additionally sensitized the nanogel particles to the presence of such reducing agents as glutathione. In the presence of glutathione the DNA strands were cleaved with the simultaneous release of the drug. The research conducted in this part of the work confirmed the dynamic reorganization of the DNA structure in the synthesized nanogel and the formation of an oligonucleotide shell on the polymer core. It has been shown that the processes occurring in the nanogels were helpful in the effective and controlled release of the drug and in partial disintegration of the nanogels. The cooperation of the conformational changes that lead to loosening of the DNA structure upon increase of temperature and the reduction of the disulfide groups resulted in an increased efficiency of drug release during the pulsatile nanogel treatment. The cellular studies might indicate that due to the presence of the nanohydrogel carrier the negative effects of the doxorubicin binding by the plasma proteins could be minimized and that resulted in a high effectiveness of the destruction of the cancer cells of the Insulinoma line

Hydrogel Nanofilaments via Core-Shell Electrospinning.

Recent biomedical hydrogels applications require the development of nanostructures with controlled diameter and adjustable mechanical properties. Here we present a technique for the production of flexible nanofilaments to be used as drug carriers or in microfluidics, with deformability and elasticity resembling those of long DNA chains. The fabrication method is based on the core-shell electrospinning technique with core solution polymerisation post electrospinning. Produced from the nanofibers highly deformable hydrogel nanofilaments are characterised by their Brownian motion and bending dynamics. The evaluated mechanical properties are compared with AFM nanoindentation tests

Cumulative release of BSA-FITC from hydrogel nanofilaments of three different compositions.

<p>For better visibility of the results, the <i>y</i> axis is in a logarithmic scale.</p

Optical (a) and fluorescence (b) micrographs of electrospun core-shell PNIPAAm/PLCL fibres.

<p>The red framed insert shows highly magnified fibres.</p

Diffusion coefficient D_a (red symbols) and D_b (blue symbols) as a function of persistence length for nine analysed filaments.

<p>Each symbol number represents data from an appropriate line of <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0129816#pone.0129816.t001" target="_blank">Table 1</a>.</p

Cumulative release of BSA-FITC from core-shell mat with NIPA hydrogel in the core, and core-shell mat with protein water solution in the core.

<p>Standard deviation was less than 5%. For better visibility of the results, the <i>y</i> axis is in a logarithmic scale.</p

Hydrogel Nanofilaments via Core-Shell Electrospinning - Fig 7

<p>a) Plot of the mean square displacement of a filament of contour length 21.5 μm as a function of lag time. The upper two plots are MSDs along the <i>a</i> and <i>b</i> axes in terms of μm², whereas the bottom one is the angular MSD in terms of mrad². b) Angle between arms of the bending filament as a function of time. c) Length of left and right arm of the bending filament, and distance between both ends of the arms. All plots present calculations for the nanofilament No. 1 from <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0129816#pone.0129816.t001" target="_blank">Table 1</a>.</p

Ribbon-like nanofilament (EA1) observed under an atomic force microscope; contour length 7 μm, width 128 nm, height 39 nm; equivalent radius R_f = 40 nm. (see file S2 Fig).

<p>Ribbon-like nanofilament (EA1) observed under an atomic force microscope; contour length 7 μm, width 128 nm, height 39 nm; equivalent radius R_f = 40 nm. (see file <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0129816#pone.0129816.s002" target="_blank">S2 Fig</a>).</p