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Evolutionary and functional analysis of gene expression regulation in Drosophila melanogaster
Die in dieser Dissertation prĂ€sentierten Ergebnisse tragen aus dem Blickwinkel der Evolutionsbiologie zu unserem VerstĂ€ndnis der Regulation von Genexpression bei. Ich verwende einen bestens bekannten Modellorganismus, die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, nicht nur als Objekt der Beobachtung, sondern auch als ein genetisches Manipulationswerkzeug, und untersuche drei verschiedene Aspekte des Prozesses, durch den die in der DNA gespeicherte Information förmlich âentfesseltâ oder umgesetzt wird zu biologischem Sinn, letztlich also zu Form und Funktion.
In Kapitel 1 zeige ich zunĂ€chst, dass eine Inaktivierung des X-Chromosomes (und somit Genregulation auf chromosomaler Ebene) in der mĂ€nnlichen Keimbahn von D. melanogaster stattfindet. Im Gegensatz zur X-Inaktivierung in weiblichen SĂ€ugetieren, wo dies in den somatischen Zellen als Mechanismus zur Dosiskompensation auftritt, ist diese Art der Inaktivierung auf die Spermatogenese beschrĂ€nkt und wurde wahrscheinlich wĂ€hrend der Genomevolution als eine Möglichkeit etabliert, schĂ€dliche Auswirkungen in Zusammenhang mit Sexualantagonismus zu umgehen. Durch P-Element-vermittelte Keimbahntransformation erhielt ich fast 50 unabhĂ€ngige Insertionen eines testisspezifischen Reportergenkonstrukts und untersuchte die dazugehörigen ReportergenaktivitĂ€ten durch Messung der EnzymaktivitĂ€t und durch quantitative RT-PCR. Autosomale Insertionen dieses Konstrukts zeigten das erwartete Muster hoher mĂ€nnchen- und testisspezifischer Expression. Insertionen auf dem X-Chromosom zeigten dagegen wenig bzw. gar keine Expression des Transgens. Da die X-chromosomalen Insertionen die euchromatischen Abschnitte des Chromosoms abdeckten (bestimmt durch inverse PCR), konnte eine systematische Bevorzugung bestimmter Regionen bei Insertionen, die ein Fehlen von Expression auf dem X-Chromosom hĂ€tte erklĂ€ren können, ausgeschlossen werden. Der Effekt scheint eine globale Eigenschaft des X-Chromosomes zu sein. Lediglich die TestisspezifitĂ€t des transgenen Konstrukts ist fĂŒr das Erscheinen des Effekts erforderlich, was somit eine Selektionshypothese fĂŒr die X-Inaktivierung erhĂ€rtet sowie einige Beobachtungen erklĂ€ren könnte, die im Zusammenhang mit der Verteilung von im MĂ€nnchen und Testis exprimierten Genen im Drosophila-Genom gemacht wurden.
In Kapitel 2 untersuche ich dann mutmaĂliche cis-regulatorische Sequenzen und ihr Vermögen, allelspezifische Genexpression zu steuern. Nachdem Microarray-Studien umfangreiche VariabilitĂ€t im PrimĂ€rmerkmal Genexpression in unterschiedlichsten Taxa aufgedeckt haben, ist eine naheliegende Frage, mit der sich Evolutionsbiologen konfrontiert sehen, die nach der dieser VariabilitĂ€t zugrunde liegenden genetischen Quelle. Neben epigenetischen Mechanismen gibt es einen Disput darĂŒber, ob regulatorische Sequenzen nahe des exprimierten Gens (cis-Faktoren) und anderswo im Genom kodierte Faktoren (trans-Faktoren) einen qualitativ und quantitativ unterschiedlichen Beitrag zur VariabilitĂ€t der Genexpression liefern. Hierzu wĂ€hlte ich ein Gen von D. melanogaster, das nachweislich konsistente Expressionsunterschiede zwischen afrikanischen und nicht-afrikanischen (âkosmopolitischenâ) StĂ€mmen zeigt, und klonierte die entsprechenden stromaufwĂ€rts flankierend gelegenen Teile jeweils in ein bakterielles Reportergenkonstrukt, um â nach erfolgreicher Integration ins Fruchtfliegengenom â direkt die von ihnen gesteuerte Auswirkung auf die Genexpression zu vergleichen. Der beobachtete Effekt war klein, jedoch signifikant, und zeigte sich nur in transgenen Fliegen, die ein X-Chromosom des afrikanischen Ausgangsstammes besaĂen. Dies legt den Schluss nahe, dass zusĂ€tzlich zu den cis-regulatorischen Faktoren auch noch trans-Faktoren (vor allem auf dem X-Chromosom) zu dem zwischen den StĂ€mmen beobachteten Expressionsunterschied beitragen.
Letztendlich untersuche ich in Kapitel 3 das PhĂ€nomen des Codon bias durch seinen Zusammenhang mit Genexpression. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes werden viele der proteinogenen AminosĂ€uren durch mehr als ein Codon kodiert. Dies ermöglicht es, synonyme Codons in einer kodierenden Gensequenz auszutauschen, ohne dabei die AminosĂ€urensequenz des kodierten Polypeptids zu verĂ€ndern. Ob dies Konsequenzen fĂŒr die produzierte Proteinmenge hat (Translationseffizienz) ist Gegenstand dieses Kapitels. Ich verglich dabei die von zwei Allelen des Gens Alkoholdehydogenase (Adh) (von D. melanogaster) vermittelte EnzymaktivitĂ€t direkt miteinander, welche sich in sieben Leucin-Codons unterschieden. Es ergab sich nahezu kein Unterschied in der ADH-EnzymaktivitĂ€t, obwohl eines der Allele aus gĂ€nzlich optimalen Leucin-Codons bestand und das andere sieben suboptimale Leucin-Codons enthielt. Da Letzteres die Wildtypform von Adh war, legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass das Adh-Gen in seiner Leucin-Codonzusammensetzung (und vielleicht auch in seiner Codonzusammensetzung allgemein) bereits ausreichend optimiert ist. Weitere Versuche, die Zahl der optimalen Leucin-Codons zu erhöhen, können sogar einen Negativeffekt hinsichtlich der Enzymproduktion haben; dies möglicherweise aufgrund einer SĂ€ttigung des tRNA-Pools und/oder der Konsequenzen verĂ€nderter mRNA-SekundĂ€rstrukturen
X Chromosome Inactivation during Drosophila Spermatogenesis
Genes with male- and testis-enriched expression are under-represented on the Drosophila melanogaster X chromosome. There is also an excess of retrotransposed genes, many of which are expressed in testis, that have âescapedâ the X chromosome and moved to the autosomes. It has been proposed that inactivation of the X chromosome during spermatogenesis contributes to these patterns: genes with a beneficial function late in spermatogenesis should be selectively favored to be autosomal in order to avoid inactivation. However, conclusive evidence for X inactivation in the male germline has been lacking. To test for such inactivation, we used a transgenic construct in which expression of a lacZ reporter gene was driven by the promoter sequence of the autosomal, testis-specific ocnus gene. Autosomal insertions of this transgene showed the expected pattern of male- and testis-specific expression. X-linked insertions, in contrast, showed only very low levels of reporter gene expression. Thus, we find that X linkage inhibits the activity of a testis-specific promoter. We obtained the same result using a vector in which the transgene was flanked by chromosomal insulator sequences. These results are consistent with global inactivation of the X chromosome in the male germline and support a selective explanation for X chromosome avoidance of genes with beneficial effects late in spermatogenesis
Experimentally Increased Codon Bias in the Drosophila Adh Gene Leads to an Increase in Larval, But Not Adult, Alcohol Dehydrogenase Activity
Although most amino acids can be encoded by more than one codon, the synonymous codons are not used with equal frequency. This phenomenon is known as codon bias and appears to be a universal feature of genomes. The translational selection hypothesis posits that the use of optimal codons, which match the most abundant species of isoaccepting tRNAs, results in increased translational efficiency and accuracy. Previous work demonstrated that the experimental reduction of codon bias in the Drosophila alcohol dehydrogenase (Adh) gene led to a significant decrease in ADH protein expression. In this study we performed the converse experiment: we replaced seven suboptimal leucine codons that occur naturally in the Drosophila melanogaster Adh gene with the optimal codon. We then compared the in vivo ADH activities imparted by the wild-type and mutant alleles. The introduction of optimal leucine codons led to an increase in ADH activity in third-instar larvae. In adult flies, however, the introduction of optimal codons led to a decrease in ADH activity. There is no evidence that other selectively constrained features of the Adh gene, or its rate of transcription, were altered by the synonymous replacements. These results are consistent with translational selection for codon bias being stronger in the larval stage and suggest that there may be a selective conflict over optimal codon usage between different developmental stages