Pharmacological and biochemical studies on the contribution of NADPH oxidases to oxidative stress in the aorta of spontaneously hypertensive rats

Vaskulärer oxidativer Stress führt zu einer Beeinträchtigung der endothelabhängigen Gefäßrelaxation. Stickstoffmonoxid scheint unter Bedingungen, wie sie bei Diabetes mellitus, Hypercholesterolämie oder arteriellem Bluthochdruck vorliegen, von Superoxid und anderen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) inaktiviert zu werden. Als Hauptquellen für ROS in Blutgefässen sind NADPH Oxidasen identifiziert worden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von NADPH Oxidasen in Aorten von 12 bis 14 Monate alten spontan-hypertensiven Ratten (SHR) im Vergleich zu gleichaltrigen Wistar Kyoto Ratten (WKY). Die in-situ Detektion von ROS mittels DHE Fluoreszenz zeigte, dass die ROS Produktion in Aorten von SHR stark erhöht ist. Die NADPH Oxidase-Inhibitoren Apocynin und die neue Substanz VAS2870, nicht aber der eNOS-Hemmstoff L-NAME oder der Xanthinoxidase-Inhibitor Oxypurinol unterdrücken diese ROS Bildung, was auf NADPH Oxidasen als Hauptquelle für oxidativen Stress hinweist. Mit diesem Befund einhergehend zeigten SHR Aorten eine erhöhte NADPH Oxidase Aktivität. NADPH Oxidasen sind Multimer-Komplexe, die aus verschiedenen zytosolischen und zwei membranständigen Untereinheiten, p22phox und einer katalytischen Nox Isoform, bestehen. In Rattenaorten sind die Isoformen Nox1, Nox2 und Nox4 exprimiert, wie mittels RT-PCR in Aortenhomogenaten von SHR und WKY bestätigt wurde. Die immunhistochemische Analyse der Gefässe deutete eine primäre Lokalisation von Nox1 in der Media an, während Nox2 in Adventitia und Intima und Nox4 in der gesamten Aortenwand gefunden wurden. Im Vergleich zu WKY, konnten erhöhte Nox1 und Nox2 Proteinspiegel im SHR-Aortenhomogenat mittels quantitativer Western Blot Analyse nachgewiesen werden, während die Nox4 Expression nicht signifikant verändert war. Weiterhin war die Nox1 Expression im Endothel der SHR Aorten hochreguliert, wie Kolokalisierungsexperimente von Nox1 mit dem glatten Muskelzell-Marker α-SM-actin und dem Endothelzell-spezifischen Marker RECA-1 zeigten. Zusammenfassend weisen diese Daten darauf hin, dass Nox1 und Nox2-basierte NADPH Oxidasen den oxidativen Stress in der Aortenwand gealteter SHR verursachen. Um zu untersuchen, ob der durch NADPH Oxidasen hervorgerufene oxidative Stress mit einer endothelialen Dysfunktion der Aorten zusammenhängt, wurde die Azetylcholin-induzierte, endothelabhängige Gefässdilatation bestimmt. In SHR-Aorten war die Relaxation im Vergleich zur WKY Kontrolle beeinträchtigt, konnte aber in Anwesenheit von Apocynin und VAS2870 signifikant verbessert werden. Diese, durch die Inhibitoren bewirkte Verbesserung der Relaxation war in WKY Aorten weniger ausgeprägt, was auf die funktionelle Relevanz der erhöhten NADPH Oxidase Aktivität hindeutet. Daraus lassen sich folgende Schlussfolgerungen ableiten: Nox1 und Nox2- basierte NADPH Oxidasen wurden als Hauptquellen für oxidativen Stress in SHR Aorten identifiziert und tragen damit signifikant zur endothelialen Dysfunktion bei. Deshalb stellt die Hemmung dieser Enzyme einen vielversprechenden, therapeutischem Ansatz dar. Der neuartige NADPH Oxidase Hemmstoff VAS2870 konnte den oxidativen Stress in SHR Aorten wirksam reduzieren und damit deren endotheliale Funktion verbessern. Somit verdeutlicht die vorliegende Arbeit das Potential von VAS2870 als experimentelles „Tool“ in der Pharmakologie von NADPH Oxidasen. Darüberhinaus stellt VAS2870 auch eine interessante Modellsubstanz für die Behandlung kardiovaskulärer und anderer mit oxidativem Stress assoziierten Erkrankungen dar

Role of NADPH Oxidase in the Endothelial Dysfunction and Oxidative Stress in Aorta of Aged Spontaneous Hypertensive Rats

Objective(s)Increased reactive oxygen species (ROS) production is implicated in the pathogenesis of arterial hypertension and the development of endothelial dysfunction. NADPH oxidase type enzyme family has been suggested to form ROS and to interfere with endothelium-dependent relaxation. However, the specific isoform of NADPH oxidases that may predominantly contribute to these events remains to be clarified. Materials and MethodsHere we investigated the expressional regulation of NADPH oxidase isoforms (NOX1, NOX2 and NOX4) in aorta of aged spontaneously hypertensive rats (SHR) in comparison to age matched Wistar Kyoto rats (WKY). Moreover, we examined the effect of in vitro inhibition of NADPH oxidase by apocynin or the novel NADPH oxidase inhibitor, VAS2870 on the vascular reactivity and ROS production.ResultsOur results showed that ROS formation was largely increased in aorta of SHR as measured by dihydroethidine (DHE) fluorescence and inhibited by apocynin or VAS2870. NADPH oxidase activity, measured by lucigenin-enhanced chemiluminescence and of NOX1 and NOX2 protein levels were increased in aortic homogenates from SHR compared to WKY. However, NOX4 protein expression was not significantly changed. Furthermore, the impaired acetylcholine-induced relaxation of SHR aorta was significantly improved in the presence of either apocynin or VAS2870. ConclusionCollectively, our data suggest that NADPH oxidases, particularly NOX1 and NOX2 are relevant sources of ROS in the aorta of aged SHR thereby cause endothelial dysfunction, and VAS2870 is effective as apocynin in reversing these consequences.Aorta, Endothelial dysfunction, Oxidative stress, Spontaneously hypertensive rat

Pharmacological and biochemical studies on the contribution of NADPH oxidases to oxidative stress in the aorta of spontaneously hypertensive rats

Vaskulärer oxidativer Stress führt zu einer Beeinträchtigung der endothelabhängigen Gefäßrelaxation. Stickstoffmonoxid scheint unter Bedingungen, wie sie bei Diabetes mellitus, Hypercholesterolämie oder arteriellem Bluthochdruck vorliegen, von Superoxid und anderen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) inaktiviert zu werden. Als Hauptquellen für ROS in Blutgefässen sind NADPH Oxidasen identifiziert worden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von NADPH Oxidasen in Aorten von 12 bis 14 Monate alten spontan-hypertensiven Ratten (SHR) im Vergleich zu gleichaltrigen Wistar Kyoto Ratten (WKY). Die in-situ Detektion von ROS mittels DHE Fluoreszenz zeigte, dass die ROS Produktion in Aorten von SHR stark erhöht ist. Die NADPH Oxidase-Inhibitoren Apocynin und die neue Substanz VAS2870, nicht aber der eNOS-Hemmstoff L-NAME oder der Xanthinoxidase-Inhibitor Oxypurinol unterdrücken diese ROS Bildung, was auf NADPH Oxidasen als Hauptquelle für oxidativen Stress hinweist. Mit diesem Befund einhergehend zeigten SHR Aorten eine erhöhte NADPH Oxidase Aktivität. NADPH Oxidasen sind Multimer-Komplexe, die aus verschiedenen zytosolischen und zwei membranständigen Untereinheiten, p22phox und einer katalytischen Nox Isoform, bestehen. In Rattenaorten sind die Isoformen Nox1, Nox2 und Nox4 exprimiert, wie mittels RT-PCR in Aortenhomogenaten von SHR und WKY bestätigt wurde. Die immunhistochemische Analyse der Gefässe deutete eine primäre Lokalisation von Nox1 in der Media an, während Nox2 in Adventitia und Intima und Nox4 in der gesamten Aortenwand gefunden wurden. Im Vergleich zu WKY, konnten erhöhte Nox1 und Nox2 Proteinspiegel im SHR-Aortenhomogenat mittels quantitativer Western Blot Analyse nachgewiesen werden, während die Nox4 Expression nicht signifikant verändert war. Weiterhin war die Nox1 Expression im Endothel der SHR Aorten hochreguliert, wie Kolokalisierungsexperimente von Nox1 mit dem glatten Muskelzell-Marker α-SM-actin und dem Endothelzell-spezifischen Marker RECA-1 zeigten. Zusammenfassend weisen diese Daten darauf hin, dass Nox1 und Nox2-basierte NADPH Oxidasen den oxidativen Stress in der Aortenwand gealteter SHR verursachen. Um zu untersuchen, ob der durch NADPH Oxidasen hervorgerufene oxidative Stress mit einer endothelialen Dysfunktion der Aorten zusammenhängt, wurde die Azetylcholin-induzierte, endothelabhängige Gefässdilatation bestimmt. In SHR-Aorten war die Relaxation im Vergleich zur WKY Kontrolle beeinträchtigt, konnte aber in Anwesenheit von Apocynin und VAS2870 signifikant verbessert werden. Diese, durch die Inhibitoren bewirkte Verbesserung der Relaxation war in WKY Aorten weniger ausgeprägt, was auf die funktionelle Relevanz der erhöhten NADPH Oxidase Aktivität hindeutet. Daraus lassen sich folgende Schlussfolgerungen ableiten: Nox1 und Nox2- basierte NADPH Oxidasen wurden als Hauptquellen für oxidativen Stress in SHR Aorten identifiziert und tragen damit signifikant zur endothelialen Dysfunktion bei. Deshalb stellt die Hemmung dieser Enzyme einen vielversprechenden, therapeutischem Ansatz dar. Der neuartige NADPH Oxidase Hemmstoff VAS2870 konnte den oxidativen Stress in SHR Aorten wirksam reduzieren und damit deren endotheliale Funktion verbessern. Somit verdeutlicht die vorliegende Arbeit das Potential von VAS2870 als experimentelles „Tool“ in der Pharmakologie von NADPH Oxidasen. Darüberhinaus stellt VAS2870 auch eine interessante Modellsubstanz für die Behandlung kardiovaskulärer und anderer mit oxidativem Stress assoziierten Erkrankungen dar

Radiation evaluation of digital isolators for space applications

Recently we presented preliminary results on TID and SEE testing of digital isolators. In this paper, we give a comprehensive summary of radiation-hardness characterization for three digital isolator’s technologies. Further, we provide overall conclusions on their suitability for space applications and give recommendations on further investigations

Oxidative Stress and Endothelial Dysfunction in Aortas of Aged Spontaneously Hypertensive Rats by NOX1/2 Is Reversed by NADPH Oxidase Inhibition

Arterial hypertension is associated with increased levels of reactive oxygen species, which may scavenge endothelium-derived NO and thereby diminish its vasorelaxant effects. However, the quantitatively relevant source of reactive oxygen species is unclear. Thus, this potential pathomechanism is not yet pharmacologically targetable. Several enzymatic sources of reactive oxygen species have been suggested: uncoupled endothelial NO synthase, xanthine oxidase, and NADPH oxidases. Here we show that increased reactive oxygen species formation in aortas of 12- to 14-month-old spontaneously hypertensive rats versus age-matched Wistar Kyoto rats is inhibited by the specific NADPH oxidase inhibitor VAS2870 but neither by the xanthine oxidase inhibitor oxypurinol nor the NO synthase inhibitor N-G-nitro-L-arginine methyl ester. NADPH oxidase activity, as well as protein expression of its catalytic subunits, NOX1 and NOX2, was increased in the aortas of spontaneously hypertensive rats, whereas the expression of NOX4 protein, the most abundant NOX isoform, was not significantly changed. Impaired acetylcholine-induced relaxation of spontaneously hypertensive rat aortas was significantly improved by VAS2870. In conclusion, NOX1 and NOX2 but not NOX4 proteins are increased in aged spontaneously hypertensive rat aortas. Importantly, these NOX isoforms, in particular, ectopic expression of NOX1 in endothelial cells, appear to affect vascular function in an NADPH oxidase inhibitor-reversible manner. NADPH oxidases may, thus, be a novel target for the treatment of systemic hypertension. (Hypertension. 2010;56:490-497.