A Small In Vitro Fermentation Model for Screening the Gut Microbiota Effects of Different Fiber Preparations

The development of prebiotic fibers requires fast high-throughput screening of their effects on the gut microbiota. We demonstrated the applicability of a mictotiter plate in the in vitro fermentation models for the screening of potentially-prebiotic dietary fibers. The effects of seven rye bran-, oat- and linseed-derived fiber preparations on the human fecal microbiota composition and short-chain fatty acid production were studied. The model was also used to study whether fibers can alleviate the harmful effects of amoxicillin-clavulanate on the microbiota. The antibiotic induced a shift in the bacterial community in the absence of fibers by decreasing the relative amounts of Bifidobacteriaceae, Bacteroidaceae, Prevotellaceae, Lachnospiraceae and Ruminococcaceae, and increasing proteobacterial Sutterilaceae levels from 1% to 11% of the total microbiota. The fermentation of rye bran, enzymatically treated rye bran, its insoluble fraction, soluble oat fiber and a mixture of rye fiber:soluble oat fiber:linseed resulted in a significant increase in butyrate production and a bifidogenic effect in the absence of the antibiotic. These fibers were also able to counteract the negative effects of the antibiotic and prevent the decrease in the relative amount of bifidobacteria. Insoluble and soluble rye bran fractions and soluble oat fiber were the best for controlling the level of proteobacteria at the level below 2%

Ravintokuitujen vaikutuksen suolistomikrobistoon tutkiminen in vitro mallin avulla ja mallin kehittäminen

Ihmiselle elintärkeä suolistomikrobisto on tärkeä tutkimuskohde monella eri tieteenalalla. Suolistomikrobiston kehittymiseen, tasapainoon sekä vuorovaikutukseen isännän kanssa vaikuttuvat monet tekijät, kuten antimikrobilääkkeet ja ruokavalio. Ylempien ruoansulatuskanavan osien läpi imeytymättä ja pilkkoutumatta kulkeutuvat kasviperäiset ravintokuidut ovat tärkeä ravinnonlähde paksusuolen bakteereille. Osa bakteereista muodostaa näistä hiilihydraateista lyhytketjuisia rasvahappoja (mm. asetaattia, propionaattia, butyraattia), jotka toimivat suoliston solujen kasvun ja aineenvaihdunnan säätelijöinä sekä energianlähteenä. Muutokset rasvahappoja tuottavien bakteerien monimuotoisuudessa ja runsaudessa on yhdistetty lukuisiin sairauksiin, kuten tulehduksellisiin suolistosairauksiin. Suolistomikrobiston tutkiminen nykyisillä analyysimenetelmillä ja koejärjestelyillä on yhä haasteellista, sillä suolisto ja mikrobit elävät monisyisessä vuorovaikutuksessa keskenään. Työssä kehitettiin in vitro -paksusuolimallia vastaamaan paremmin tutkimuksen tarpeita ja seulottiin yli 40 erilaista kuitunäytettä jatkotutkimuksia varten. Tässä työssä tarkasteltiin ravintokuitujen aiheuttamia muutoksia suolistomikrobistossa yksikammioissessa, staattisessa in vitro-paksusuolimallissa (eng. batch model). Malli on tarkoitettu suurten näytemäärien nopeaan seulontaan. Kuitunäytteitä oli käsitelty eri menetelmillä paremman liukoisuuden ja fermentoitavuuden saavuttamiseksi. Työssä keskityttiin erityisesti butyraatintuottajabakteereihin, bifidobakteereihin sekä propionaattia tuottavaan Akkermansia muciniphila -bakteeriin. Bakteerien määrää tarkasteltiin selektiivisillä kasvatusalustoilla, kvantitatiivisella PCR:llä sekä karakterisoitiin bakteeripopulaatiota sekvensoimalla 16S rRNA-geeniin perustuen. Jotta työssä saatettiin kvantitoida eläviä solujen määrää DNA-pohjaisilla menetelmillä, näytteitä käsiteltiin propidiummonoatsidilla (PMA), joka estää hajonneista soluista peräisin olevan kaksijuosteisen DNA:n monistumisen PCR:ssä. Mallissa happamat rasvahapot kertyvät näytematriisiin ja inkuboinnin aikana laskevat pH:ta huomattavasti, jolloin mallin olosuhteet eivät enää mallinna paksusuolen olosuhteita. Työssä vertailtiin kahta eri puskuriliuosta, pH:n säätöä emäksellä sekä lyhempää inkubointiaikaa. Etenkin A. muciniphila -bakteerin ja butyraatin tuottajien määrän havaittiin vähenevän happamassa suspensiossa ja happokestoisten bakteerien osuuden kasvavan huomattavasti ja muodostavan valtaosan bakteeripopulaatiosta. PMA-käsittelyn optimointi ulostesuspensionäytteille osoittautui haastavaksi näytematriisien vaihtelevasta koostumuksesta johtuen. Ravintokuiduilla havaittiin olevan toisistaan eroavia vaikutuksia bakteeripopulaatioon: liukoisimmat kuidut saivat aikaan suurimman pH:n laskun ja näin ollen suuremman happokestoisten bakteerien osuuden bakteeripopulaatiossa.Human gut microbiota is an important topic for many different disciplines. Various factors, e.g. antimicrobial drugs and diet, affect the development and balance of gut microbiota and its interactions with the host. Plant based carbohydrates that transit unabsorbed and undigested through the upper parts of gastrointestinal tract are an important source of energy for the colon bacteria. Some of colon bacteria produce short chained fatty acids (e.g. acetate, propionate, butyrate) from these carbohydrates. SCFAs provide a source of energy and regulate the cell growth and metabolism. The changes in the diversity and abundance of the SCFA producing bacteria have been linked to many gut related diseases. Studying gut microbiota with today’s analytical methods is still challenging. In this work the effects of dietary fibers on gut microbiota were monitored with a static, single vessel batch model. A batch model is typically developed for the quick high-throughput screening of samples. Fiber samples were processed in various ways to increase their solubility and thus fermentability. In this work butyrate producing bacteria, Akkermansia muciniphila and bifidobacteria were targeted. Enumeration was performed with selective growth media and quantitative PCR. Bacterial population was characterized by 16S rRNA based sequencing. To quantitate only viable bacterial cells from the sample matrix by qPCR, samples were treated with propidium monoazide (PMA), which after light activation inhibits the amplification of double-stranded DNA from dead and lysed cells. Since acidic SCFAs accumulate in the sample suspension, pH decreases clearly during the incubation in the static model. This leads to conditions which do not resemble the ones in the colon. Two different buffer solutions, pH adjustment and shorter incubation time were tested to overcome this challenge. The numbers of A. muciniphila and some of the butyrate producers decreased in acidic environment and the proportion of acid-tolerant bacteria was clearly increased and dominated the bacterial population. The optimization of PMA treatment for fecal suspension samples proved to be challenging due to the highly variable composition of sample matrixes. Dietary fibers were observed to cause different changes in bacterial population: the most soluble fibers caused greater decrease of pH and thus greater proportion of acid tolerant bacteria in the population

A Small In Vitro Fermentation Model for Screening the Gut Microbiota Effects of Different Fiber Preparations

The development of prebiotic fibers requires fast high-throughput screening of their effects on the gut microbiota. We demonstrated the applicability of a mictotiter plate in the in vitro fermentation models for the screening of potentially-prebiotic dietary fibers. The effects of seven rye bran-, oat- and linseed-derived fiber preparations on the human fecal microbiota composition and short-chain fatty acid production were studied. The model was also used to study whether fibers can alleviate the harmful effects of amoxicillin-clavulanate on the microbiota. The antibiotic induced a shift in the bacterial community in the absence of fibers by decreasing the relative amounts of Bifidobacteriaceae, Bacteroidaceae, Prevotellaceae, Lachnospiraceae and Ruminococcaceae, and increasing proteobacterial Sutterilaceae levels from 1% to 11% of the total microbiota. The fermentation of rye bran, enzymatically treated rye bran, its insoluble fraction, soluble oat fiber and a mixture of rye fiber:soluble oat fiber:linseed resulted in a significant increase in butyrate production and a bifidogenic effect in the absence of the antibiotic. These fibers were also able to counteract the negative effects of the antibiotic and prevent the decrease in the relative amount of bifidobacteria. Insoluble and soluble rye bran fractions and soluble oat fiber were the best for controlling the level of proteobacteria at the level below 2%