Wechselwirkungen zwischen Chromophor und Proteinmatrix in den autofluoreszierenden Proteinen GFP und drFP583 (DsRed)

Durch die genetische Fusion mit dem Grün Fluoreszierenden Protein können seit 1994 Proteine oder Genexpression in vivo visualisiert werden, ein bedeutender Fortschritt für die Lebenswissenschaften. Die Nutzungsmöglichkeiten können z. B. mit der gleichzeitigen Verwendung von fluoreszenzspektroskopisch unterscheidbaren GFP-Varianten (multispektrale Detektion) erweitert werden. Eine Veränderung der spektralen Eigenschaften des Proteins unter Beibehaltung seiner Funktionalität in vivo kann nur durch Mutagenese erfolgen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, einen Beitrag zur grundlegenden Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen dem Chromophor und der umgebenden Proteinmatrix zu leisten. Durch die Substitution von T203 in wt-GFP kann gezeigt werden, dass die B-Spezies gegenüber der A- und der I-Spezies durch eine Wasserstoff-Brücke von T203 zum Chromophor gekennzeichnet ist. Diese bewirkt gegenüber der I-Spezies ein Blauverschiebung der Absorption um ca. 23 nm. Die I-Spezies kann durch Doppelmutationen stabilisiert werden und stellt unter den GFP-Varianten einen neuen spektralen Phänotyp dar. Die Tendenz zur Dimerisierung ermöglicht die absorptionsspektroskopische Darstellung einer Population der I-Spezies in wt-GFP. Gleichzeitig wird das Dimerisierungsmodell experimentell bestätigt und mit einer relativ schwachen Dimerisierungskonstante von ca. 3 mM-1 ergänzt. Die spektroskopischen Eigenschaften wichtiger GFP-Varianten lassen sich nun mit einem molekularen Modell erklären. So wird bewiesen, dass die Absorptionsrotverschiebung um 33 nm durch die Mutation T203Y (YFP-Varianten) nur zu ca. 1/3 auf spezifisch aromatischen Wechselwirkungen beruht. Zusammen mit den EGFP-Varianten eignet sich die T203V-Variante für eine neue Art der multispektralen Detektion auf der Grundlage der sehr gut separierten Anregungsspektren. Die Kenntnisse über die Vorgänge bei der Dimerisierung von wt-GFP bzw. GFPuv lassen sich prinzipiell für die intrazelluläre und lokale in vivo-Messung effektiver Proteinkonzentrationen bzw. von Protein-Protein-Wechselwirkungen nutzen. Durch kombinatorische Mutagenese wurde deutlich, dass der schnelle Protonentransfer (ESPT) nach Anregung der A-Spezies das negativ geladene E222 als Akzeptor benötigt. Ansonsten wird der Prozess deutlich verlangsamt, was mit einer entsprechenden Abnahme der Quantenausbeute für die grüne Emission einhergeht. In der Variante S65G/T203V/E222Q wird zusätzlich der strahlunglose Verlust der Anregungsenergie von A* stark verringert. Dadurch dominiert die blaue A*-Emission das Emissionsspektrum. Dieser neue spektrale GFP-Phänotyp ist für multispektrale Anwendungen geeignet. Von den GFP-homologen Proteinen, die erst seit Ende 1999 entdeckt werden, hat das stark rot emittierende aus Discosoma (DsRed) die langwelligste Emission und ist deshalb für in vivo Applikationen am interessantesten. Es wird bewiesen, dass der Chromophor des Proteins über die langsame kovalente Modifikation des intermediär entstehenden GFP-Chromophors gebildet wird. Mit der Entfaltung des Proteins wird dieser Prozess teilweise revertiert. Aus einer Proteinbibliothek konnten Varianten identifiziert werden, in denen räumlich gruppierte Einzelmutationen diesen finalen Maturierungsschritt in verschiedenem Ausmaß unterdrücken. Die Emission des intermediären GFP-Chromophors kann von dem finalen DsRed-Chromophor absorbiert werden (FRET), was auf eine starke Oligomerisierung hindeutet

The Photophysics of Green Fluorescent Protein: Influence of the Key Amino Acids at Positions 65, 203, and 222

The three amino acids S65, T203, and E222 crucially determine the photophysical behavior of wild-type green fluorescent protein. We investigate the impact of four point mutations at these positions and their respective combinations on green fluorescent protein's photophysics using absorption spectroscopy, as well as steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy. Our results highlight the influence of the protein's hydrogen-bonding network on the equilibrium between the different chromophore states and on the efficiency of the excited-state proton transfer. The mutagenic approach allows us to separate different mechanisms responsible for fluorescence quenching, some of which were previously discussed theoretically. Our results will be useful for the development of new strategies for the generation of autofluorescent proteins with specific photophysical properties. One example presented here is a variant exhibiting uncommon blue fluorescence