Effects of High-Mobility Group A Protein Application on Canine Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells In Vitro

Multipotency and self-renewal are considered as most important features of stem cells to persist throughout life in tissues. In this context, the role of HMGA proteins to influence proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cell (ASCs) while maintaining their multipotent and self-renewal capacities has not yet been investigated. Therefore, extracellular HMGA1 and HMGA2 application alone (10–200 ng/mL) and in combination with each other (100, 200 ng/mL each) was investigated with regard to proliferative effects on canine ASCs (cASCs) after 48 hours of cultivation. Furthermore, mRNA expression of multipotency marker genes in unstimulated and HMGA2-stimulated cASCs (50, 100 ng/mL) was analyzed by RT-qPCR. HMGA1 significantly reduced cASCs proliferation in concentrations of 10–200 ng/mL culture medium. A combination of HMGA1 and HMGA2 protein (100 and 200 ng/mL each) caused the same effects, whereas no significant effect on cASCs proliferation was shown after HMGA2 protein application alone. RT-qPCR results showed that expression levels of marker genes including KLF4, SOX2, OCT4, HMGA2, and cMYC mRNAs were on the same level in both HMGA2-protein-stimulated and -unstimulated cASCs. Extracellular HMGA protein application might be valuable to control proliferation of cASCs in context with their employment in regenerative approaches without affecting their self-renewal and multipotency abilities

Vorstellung einer Zellkulturkammer zur elektrischen Stimulation von Spiralganglienzellen (SGZ)

Nach Tierversuchen mit ertaubten und einseitig mit einem Cochlea-Implantat versorgten Meerschweinchen (Kanzaki et al., 2002) konnte gezeigt werden, daß die Anzahl der überlebenden Spiralganglienzellen im Vergleich zu einer nicht implantierten Kontrollgruppe signifikant erhöht war. Diese Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, daß eine elektrische Stimulation und damit auch das Cochlea-Implantat an sich einen protektiven Effekt in Bezug auf das Spiralganglienzellüberleben hat. Die optimalen Stimulationsparameter hinsichtlich einer elektrischen Stimulation von Spiralganglienzellen sind bisher weitgehend unbekannt.Zur Untersuchung der vorgenannten Fragestellung wurde eine Zellkulturkammer entwickelt, die es ermöglicht Spiralganglienzellen unter definierten Bedingungen in einem Wechselfeld zu kultivieren. Nach einem Test der Kammer auf pH- und Temperatur-Konstanz des Zellkulturmediums unter Stimulationsbedingungen wurden initiale Versuche mit PC-12-Zellen (Phäochromocytomzellen) durchgeführt. Diese Tumorzellinie stammt aus dem Nebennierenmark der Ratte und wurde aufgrund der Fähigkeit dieser Zellen unter bestimmten Bedingungen neuritenartige Ausläufer zu bilden, als Modellsystem für neuronale Zellen ausgewählt. Die Stimulation der Zellen erfolgte bei konstanter Spannung über einen Zeitraum von 48h mit Stimulationszügen von 50 biphasischen Pulsen (10 ms, 50 Hz) und einem Interburst-Interval von 19 s. Über den Stimulationszeitraum blieben sowohl der pH-Wert als auch die Temperatur des Zellkulturmediums konstant. Die Zellkulturkammer bietet damit die Möglichkeit einer einfachen und reproduzierbaren Untersuchung protektiver Effekte einer elektrischen Stimulation auf Spiralganglienzellen

Nachweis von Faktoren und Rezeptoren der Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor (GDNF)-Familie auf Spiralganglienzellen adulter Ratten

Seit einigen Jahren liegt ein Schwerpunkt der Innenohrforschung in der Aufklärung der Effekte Neurotropher Faktoren (NTF) auf Spiralganglienzellen (SGZ). In verschiedenen Studien wurden für diese Faktoren protektive und trophische Effekte auf Spiralganglienzellen nachgewiesen. Für den Erfolg einer Cochlea-Implantat (CI) Versorgung ist die Anzahl der einer elektrischen Reizung durch das Implantat zur Verfügung stehenden SGZ entscheidend. Durch Applizierung Neurotropher Faktoren in das Innenohr könnte das in Folge von Hörminderung oder Ertaubung fortschreitende Zugrundegehen der SGZ gestoppt werden. Dies würde die Anzahl der einer Reizung durch das CI zur Verfügung stehenden SGZ auf hohem Niveau konstant halten und dadurch zu einem verbesserten Erfolg einer Cochlea-Implantat Versorgung beitragen. In der vorliegenden Studie wurden die Faktoren der GDNF-Familie (GDNF, Artemin, Persephin, Neurturin) sowie deren Rezeptoren mittels Immunfluoreszenztest an histologischen Schnitten der Cochlea adulter Ratten und neonataler Ratten (p 3-5) untersucht. Dazu wurden die Cochleae präparatorisch dargestellt und zur Anfertigung von Paraffinschnitten weiterverarbeitet. Die Immunfluoreszenzfärbung erfolgte unter Verwendung antigenspezifischer Primärantikörper (rabbit IgG, 1: 40) und einem FITC-konjugierten Sekundärantikörper (goat-anti-rabbit IgG, 1:50).Unsere Ergebnisse bestätigen den Nachweis von GDNF und seinen Rezeptoren GFRalpha1 und Ret in Spiralganglienzellen sowohl von adulten als auch von neonatalen Ratten. Die Untersuchung der übrigen Mitglieder der GDNF-Familie lässt darauf schließen, dass auch Artemin eine Rolle hinsichtlich des Spiralganglienzellüberlebens spielen könnte und machen es zu einem interessanten Kandidaten für weitere Untersuchungen

Untersuchungen zum protektiven Effekt einer Kombination aus elektrischer Stimulation und Dexamethason auf Spiralganglienzellen experimentell ertaubter Meerschweinchen

Ertaubung durch Haarzellverlust führt zu einer fortschreitenden Degeneration der Spiralganglienzellen (SGZ). Deren Erhalt ist für den Erfolg eines Cochlea Implantats (CI) mit von entscheidender Bedeutung.Untersuchungen belegen, dass das Überleben der SGZ durch die elektrische Stimulation (ES) gefördert werden kann. Dexamethason (DEX) als Entzündungshemmer kann Bindegewebsneubildung entlang des Implantats hemmen und somit die Nerv-Elektrodeninteraktion optimieren helfen.Der Effekt einer Kombination beider Interventionsmethoden könnte zu einer Verbesserung der Erfolge eines CI führen.Zunächst wurden normal hörende Meerschweinchen systemisch ertaubt. 21 Tage nach der Ertaubung erfolgte die linksseitige Implantation eines kombinierten Elektroden-Mikropumpsystems. Zwei Versuchsgruppen wurden gebildet: Den Tieren beider Gruppen wurde ab dem Tag der Implantation 100µg pro ml DEX lokal appliziert. Eine Gruppe (N=5) wurde bis zum Abschluss des Versuchszeitraums (48 Tage nach Ertaubung) elektrisch stimuliert, die andere Gruppe (N=6) wurde nur mit DEX behandelt. Als Kontrollgruppe fungierte die jeweils unbehandelte rechte Seite.27 Tage nach der Implantation wurden den Tieren die Cochleae entnommen und die SGZ-Dichten bestimmt.Die Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination aus DEX und ES zu einer signifikanten Erhöhung der Spiralganglienzell-Überlebensrate führt, wohingegen die alleinige DEX Applikation keine Protektion der Zellen hervorzurufen scheint.Die dargestellten Ergebnisse belegen, dass die ES trotz gleichzeitiger DEX Applikation zu einer Erhöhung der SGZ-Dichte führt. Inwieweit lokal appliziertes DEX die spiralganglienzellprotektierende Wirkung der elektrischen Stimulation beeinflusst, wird in weiteren Untersuchungen bestimmt

Regulation der Genexpression der Mitglieder der NGF- und TGFbeta-Familie im Modiolus ertaubter Ratten

Lärm und ototoxische Substanzen bewirken einen irreversiblen Hör- und Haarzellverlust. Neurotrophe Faktoren (NTF) spielen sowohl in der Entwicklung als auch in der Regenerationsfähigkeit neuronaler Systeme eine zentrale Rolle. Untersuchungen des Genexpressionsprofils der Mitglieder der glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)-Familie im Innenohr ertaubter Ratten mittels RT-PCR wiesen auf einen wichtigen Beitrag von Artemin und GDNF zum Erhalt der SGZ hin. In dieser Studie wurden Gen- und Proteinexpressionsanalysen von brain-derived neurotrophic factor (BDNF) und den Tyrosinkinase-Rezeptoren trkA-trkC, fibroblast growth factor 1 (FGF1), transforming growth factor-beta (TGFbeta) 1 und 2, sowie dessen Rezeptoren im Innenohr ertaubter Ratten durchgeführt. 26 Tage nach der Ertaubung durch Injektion von Neomycin in das Innenohr wurden den ertaubten und unbehandelten Ratten Colliculus inferior und Modiolus entnommen und deren RNA extrahiert. Während die RNA-Expressionsanalyse semiquantitativ durch RT-PCR erfolgte, wurde die gewebespezifische Proteinexpression in der Cochlea lokalisiert. Zusammengefaßt wurde die BDNF-Genexpression im Colliculus inferior infolge der Ertaubung supprimiert, im Modiolus jedoch signifikant angehoben. Erhöhte trkA-Transkriptmengen wurden in beiden untersuchten Geweben gefunden, während trkB-mRNA, Hauptrezeptor für BDNF, im Modiolusgewebe ertaubter Ratten nicht nachweisbar war. Eine differentielle Genexpression von trkC und FGF1 wurde in keinem Gewebe gefunden. Die Ergebnisse der Expressionsstudien vermitteln ein weitergehendes Verständnis der NTF-Signalwege in der Cochlea und eröffnen so Perspektiven für neuartige Innenohrtherapien