Quantification des radicaux libres par mesure de la durée de vie de fluorescence : sondes à base de pyrène spécifiques pour les compartiments subcellulaires

Abstract: Fluorescence microscopy plays an essential sensing role in biology owing to the rapid advancement of fluorescent techniques and new engineered fluorophores. While it is necessary to investigate biological processes, there is still a growing need to develop new measurement approaches that can allow in cellulo measurement of several analytes and metabolic byproducts. Among these, Reactive Oxygen Species (ROS) have been widely mentioned, along with intracellular signaling and human pathologies. ROS's different involvements in many cellular physiological roles raise the question of their intracellular roles depending on type and dose. To better quantify their spatial and temporal production, we design and synthesize organic fluorophores based on a long fluorescence lifetime probe, pyrene butyric acid. These lifetime-based sensing probes have both merits of a long fluorescence lifetime (a few hundred nanoseconds) and a mitochondrial vector, aiming at quantifying ROS in its proximity. Using fluorescence lifetime technique has the advantage in its probe concentration independence, an indispensable property when working in cells. In this thesis, we characterize the probe's photophysical behavior in solution with different ROS models (i.e., probe photostability, ROS quenching efficiency, etc.). Once their in-solution functionality is validated, we introduce the probes inside several cultured cells (adherent and not adherent) to detect cellular ROS levels. We also measure the extent of the probes' cytotoxicity to compare the probe's impact on a cell line, aiming at having a minimum cellular effect. Our goal extends to find the best fit for a Cargo-transport model featuring a lifetime-based fluorescent marker. These vectors localize in mitochondria to their positive charge and lipophilic group characteristics (i.e., mitochondrial targeting peptides (MTP), triphenylphosphonium salt (TPP+)). Several probes were synthesized using different mitochondrial vectors to improve the sensing output, assuring efficient cellular uptake and maximal mitochondrial localization.La microscopie de fluorescence joue un rôle important dans la détection biologique grâce au développement rapide des techniques de fluorescence et nouveaux fluorophores. Étant donné la nécessité d'étudier les processus biologiques par des mesures non invasives, il existe toujours un besoin croissant de développer de nouvelles approches de fluorescence qui permettraient la mesure in cellulo d’analytes et des sous-produits métaboliques. Parmi ces composés, les espèces réactives de l'oxygène (ROS en anglais) sont de grande importance, car elles sont impliquées dans la signalisation intracellulaire et les pathologies humaines. Ces différentes implications dans des rôles physiologiques cellulaires soulèvent la question de leurs rôles en fonction de leur type, concentrations, et de leur distribution. Durant cette thèse, des fluorophores organiques ont été synthétisés. Ces sondes de détection ont à la fois les avantages d'une longue durée de vie de fluorescence du fluorophore : l’acide pyrène butyrique (quelques centaines de nanosecondes) et d’un vecteur qui va conduire le fluorophore vers la mitochondrie, l’ensemble visant à quantifier les ROS à sa proximité. Au cours de cette thèse, nous avons caractérisé le comportement photophysique des sondes en solution en présence de différents modèles de ROS (c.-à-d. la photostabilité de la sonde, l’efficacité de sa désactivation, etc.). Les sondes ont aussi été introduites dans diverses lignées cellulaires (cellules adhérentes et non adhérentes) pour détecter les niveaux de ROS intracellulaires et mesurer la cytotoxicité des sondes. Les deux vecteurs mitochondriaux utilisés sont caractérisés par leur charge positive et leurs groupes lipophiles. Ce sont un peptide de ciblage mitochondrial (MTP) et un sel de triphénylphosphonium (TPP+). Plusieurs sondes ont été synthétisées à l'aide de ces deux vecteurs afin d’améliorer l’intensité du signal de fluorescence, assurer une pénétration efficace dans les cellules, une toxicité minimale et une localisation mitochondriale

Peptide Vectors Carry Pyrene to Cell Organelles Allowing Real‐Time Quantification of Free Radicals in Mitochondria by Time‐Resolved Fluorescence Microscopy

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