Establishment and characterisation of local clonal Eimeria tenella populations

Eimeria is an obligate intracellular parasite which invades the intestinal tract of fowl and causes coccidiosis. There are seven known species of avian Eimeria: E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox and E. tenella (Williams, 1996)

Pengenalpastian protein membran putatif dalam sporozoit eimeria tenella melalui penyaringan imuno

Dalam parasit intrasel obligat seperti Eimeria tenella, protein membran dipercayai memainkan peranan yang penting dalam pengecaman dan pelekatan pada sel perumah supaya proses penyerangan parasit ke dalam sel perumah dapat disempurnakan. Untuk mengenalpasti protein pada membran E. tenella, penyaringan imuno telah dilakukan dengan menggunakan antiserum terhadap fraksi subsel yang telah diperkayakan dengan protein membran sporozoit. Usaha penyaringan imuno ini berjaya memencilkan 21 klon positif. Daripada jumlah ini, 13 klon menunjukkan pemadanan bermakna dengan jujukan dalam pangkalan data, iaitu 11 dengan protein mikronem EtMIC4, satu dengan EtMIC1 dan satu lagi dengan EtMIC2. Lapan klon selebihnya yang tidak menunjukkan sebarang pemadanan bermakna dengan jujukan dalam pangkalan data didapati membawa lima gen yang berlainan. Secara keseluruhannya, hasil kajian ini menunjukkan bahawa kaedah penyaringan imuno berupaya mengenalpasti gen baru yang kemungkinan besar mengekodkan protein membran dalam sporozoit E. tenella

Pencirian molekul glikogen sintase kinase-3 dari Eimeria tenella

Penemuan sasaran dadah antikoksidia baharu merupakan antara usaha yang diperlukan untuk mengawal penyakit koksidiosis ayam yang disebabkan oleh spesies Eimeria. Dalam kajian ini, serpihan yang mengekodkan glikogen sintase kinase-3 (GSK-3) Eimeria tenella putatif telah diamplifikasi daripada cDNA E. tenella. Hasil pemadanan homologi menunjukkan jujukan GSK-3 E. tenella yang terjana mempunyai padanan yang tinggi dengan jujukan GSK-3 organisma lain. Domain terpulihara GSK-3 dan residu yang penting untuk aktiviti GSK-3 juga diramalkan hadir dalam jujukan GSK-3 E. tenella. Analisis struktur sekunder serta pemodelan homologi menunjukkan pembahagian struktur protein kepada domain bebenang beta pada hujung N dan domain heliks alfa pada hujung C, yang merupakan ciri enzim GSK-3. Kesemua hasil analisis ini menyokong bahawa jujukan yang dikaji mengekodkan protein GSK-3 dalam E. tenella. Walaupun darjah keterpuliharaan adalah tinggi, namun terdapat perbezaan yang bermakna diperhatikan antara GSK-3 E. tenella dan perumahnya. Residu Ser 9 yang dilaporkan penting untuk perencatan aktiviti GSK-3 didapati tidak terpulihara dalam GSK-3 E. tenella. Memandangkan Ser 9 merupakan tapak pemfosfatan bagi GSK-3β dalam haiwan vertebrata, ketiadaan residu ini dalam jujukan GSK-3 E. tenella mencadangkan bahawa pengawalaturan GSK-3 E. tenella melibatkan tapak pemfosfatan dan mekanisme yang berbeza. Tambahan pula, hasil analisis filogenetik menunjukkan bahawa GSK-3 E. tenella mempunyai pertalian yang rapat dengan protein GSK-3 tumbuh-tumbuhan. Analisis superposisi GSK-3 E. tenella dengan GSK-3β Homo sapiens pula menunjukkan bahawa perencat GSK-3 mampu berinteraksi dengan protein GSK-3 E. tenella. Keputusan kajian ini mencadangkan bahawa GSK-3 E. tenella mempunyai potensi untuk diperkembangkan sebagai sasaran dadah antikoksidia

Molecular characterisation of Eimeria tenella porin, a potential anticoccidial drug target

Eimeria tenella is an apicomplexan parasite that causes the economically important disease coccidiosis in chickens. An estimated loss over $3 billion USD per annum has been reported. Control of coccidiosis relies on chemotherapy and vaccination but drug resistance is common and live vaccines are relatively expensive. Therefore, there is an urgent need to develop new drugs to control Eimeria infections. Recent studies have shown that the pore forming structures of porin play important roles in many eukaryotic organisms. In this study, we have generated and characterised a putative porin cDNA sequence from E. tenella that we have named Etporin. Sequence alignments showed that Etporin is 47 % similar to the putative porin sequence of Toxoplasma gondii, while a search against the Conserved Domain Database (CDD) shows that Etporin contains the Porin3 superfamily domain. Multiple sequence alignment with porin sequences from various eukaryotic organisms showed that the conserved VKXKX and GLK/STK motifs are present in Etporin. Analysis of the predicted Etporin 3D structure showed a classic beta barrel structure consisting of 19 beta-strands. Taken together, these results suggested Etporin has the potential to be developed into an anticoccidial drug target

Pengimunan protein rekombinan SAG2 Eimeria tenella melindungi ayam terhadap kesan penyakit koksidiosis

Pengawalan penyakit koksidiosis ayam yang disebabkan oleh jangkitan parasit Eimeria melibatkan penggunaan vaksin hidup. Namun, kaedah ini mempunyai batasan disebabkan kos pengeluarannya yang tinggi secara relatif dan hanya memberikan perlindungan yang terhad disebabkan oleh sifat Eimeria yang khusus-hos. Justeru, vaksin rekombinan diperkenalkan sebagai strategi alternatif. Antigen permukaan-2 (SAG2) Eimeria tenella telah dikenal pasti berupaya merangsang gerak balas imun ayam berikutan jangkitan. Oleh itu, dalam kajian ini, protein rekombinan SAG2 terlarut telah dihasil dan digunakan dalam pengimunan ayam. Hasil ELISA menggunakan sampel ayam terimun menunjukkan bahawa program pengimunan berjaya merangsang penghasilan antibodi-khusus SAG2 pada ayam terimun. Antibodi IgG, IgM dan IgA khusus-SAG2 pada serum ayam berjaya dikesan selepas suntikan perangsang yang pertama, manakala IgA rembesan khusus-SAG2 dikesan pada sampel kandungan mukosa ayam yang telah melengkapkan keseluruhan program pengimunan. Ayam seterusnya telah diberikan jangkitan cabaran oosista tersporulasi E. tenella. Hasil menunjukkan bahawa ayam terimun menghasilkan bilangan oosista yang lebih rendah berbanding dengan ayam tidak terimun (p<0.05) dan ini mencadangkan keupayaan protein rekombinan SAG2 untuk melindungi ayam terhadap kesan jangkitan E. tenella. Secara keseluruhannya, hasil kajian ini menunjukkan kesesuaian protein rekombinan SAG2 E. tenella sebagai calon vaksin rekombinan bagi penyakit koksidiosis

High-throughput sequencing and analysis of chromosome one of Eimeria tenella (Houghton strain)

Eimeria tenella is one of the most common Eimeria species that causes coccidiosis. This species is also highly pathogenic and it is the most common species occurring in the field. Eimeria tenella is also related to other protozoan parasites placed under the same phylum such as Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii and ryptosporidiu

The Escherichia coli motA flagellar gene as a potential integration site for large synthetic DNA

Escherichia coli is used as a chassis for many synthetic biology applications. However, the limitations of maintaining recombinant plasmids extra-chromosomally include increased metabolic burden to the host, constant selective pressure, variable plasmid copy number and plasmid instability that leads to curing. Hence, to overcome these limitations, DNA constructs are integrated into the bacterial chromosome to allow stable control of copy number and to reduce the metabolic burden towards the surrogate host. Non-essential E. coli flagellar genes have been proposed as potential chromosomal insertion target sites. In this study, we validated and compared the efficiency of two loci, namely motA and flgG, as target sites for synthetic biology applications. To enable this comparison, a dual reporter strain (DRS) that utilises two reporter proteins, EforRED and Venus, was developed as a test case. Initially, a yellow reporter plasmid k14.1_Venus was constructed and subsequently used as the plasmid backbone for the generation of two other plasmids, k14.1_eforRED and pcat_Venus, required to build the dual reporter strain. In the DRS, the eforRED gene was inserted into flgG whereas motA was disrupted by Venus. This mutant strain was defective in motility (p<0.001) but growth rate was unaffected. The fluorescence emitted by Venus was higher (p<0.05) compared to EforRED, suggesting that motA is the better chromosomal target locus compared to flgG. Hence, this study proposes the use of E. coli motA as the site for chromosomal insertion for future synthetic biology applications

Isolation and establishment of Eimeria tenella populations from local broiler chicken farms

Coccidiosis is a major intestinal disease in the chicken production industry that is caused by one or more of the seven Eimeria species known to infect chickens. Development of effective diagnostic methods and controls requires comprehensive knowledge on the Eimeria species in the local population, particularly the pathogenic E. tenella. In this study, 35 faecal samples were collected from local chicken farms, and through microscopic observation, nine samples (26%) were found to contain Eimeria oocysts. Subsequently, two positive samples, namely NSN6 and SGR6, were selected and propagated via passage in coccidian-free chickens. Species identification analyses based on oocyst morphological characterisation suggested the presence of small-sized oocysts (E. acervulina and/or E. mitis) and medium-sized oocysts (E. necatrix, E. tenella, and/or E. praecox) in NSN6 while in SGR6, the large-sized oocysts (E. brunetti and/or E. maxima) were also present in addition to the small and medium-sized oocysts. Subsequently, species identification with PCR using species-specific primers was successful in determining the presence of specific Eimeria species, which are E. acervulina and E. tenella in NSN6, and E. acervulina, E. tenella, and E. maxima in SGR6. The E. tenella populations of NSN6 and SGR6, namely EtNSN6 and EtSGR6, respectively, were established via passage in coccidian-free chickens and oocyst recovery from the caeca. The purity of EtNSN6 and EtSGR6 populations were confirmed based on oocyst morphological characterisation and PCR. The established EtNSN6 and EtSGR6 populations would be useful as research models for local strains in the development of more effective control methods

Pencirian jujukan genom mitokondria spesies Rafflesia (Rafflesiaceae) di Semenanjung Malaysia

Rafflesia terkenal sebagai tumbuhan yang menghasilkan bunga tunggal yang terbesar di dunia. Namun, ia semakin jarang ditemui dan ialah spesies dalam bahaya. Sistem pengelasan spesies Rafflesia ialah komponen penting dalam usaha pemuliharaan lazimnya bergantung kepada pencirian morfologi bunga. Walau bagaimanapun, pendekatan molekul, termasuk yang berasaskan kepada jujukan genom mitokondria (mtDNA), berupaya menyediakan kaedah pengelasan yang lebih berkesan. Untuk meneroka kemungkinan ini, jujukan mtDNA empat spesies Rafflesia di Semenanjung Malaysia, iaitu R. cantleyi, R. azlanii, R. kerrii dan R. sharifah-hapsahiae telah dihimpun dan dicirikan dalam kajian ini. Bacaan jujukan mtDNA untuk setiap spesies kajian pada mulanya telah ditentukan masing-masing daripada set data genom keseluruhan menggunakan pendekatan pemetaan berbantukan rujukan. Proses penghimpunan secara de novo dan perancahan kemudiannya telah dijalankan ke atas bacaan jujukan yang telah dikenal pasti untuk menghasilkan jujukan mtDNA bagi R. cantleyi (441,992 pb), R. azlanii (472,723 pb), R. kerrii (500,932 pb) dan R. sharifah-hapsahiae (453,747 pb). Seterusnya, anotasi mtDNA bagi setiap spesies telah mengenal pasti sekurang-kurangnya 31 gen pengekodan protein, enam gen tRNA dan tiga rRNA. Perbandingan gen mitokondria mendapati bahawa beberapa gen seperti cob, rpl10, mttB dan ccmB mempamerkan orientasi yang berbeza dalam spesies Rafflesia yang tertentu manakala analisis penjajaran jujukan berganda menunjukkan jujukan gen nad1 adalah berbeza antara keempat-empat spesies Rafflesia yang dikaji. Analisis filogenetik dengan menggunakan jujukan bagi tujuh gen pengekodan protein yang terpelihara berupaya membezakan spesies Rafflesia yang dikaji. Kesimpulannya, hasil pencirian jujukan mDNA menunjukkan bahawa jujukan gen mitokondria yang khusus berupaya membezakan spesies Rafflesia yang dikaji dan berpotensi untuk digunakan bagi tujuan pengenalpastian serta pengelasan spesies Rafflesia dalam usaha pemuliharaan organisma yang unik ini

Rafflesia tuanku-halimii (Rafflesiaceae), a new species from Peninsular Malaysia

Rafflesia tuanku-halimii, a new species from Peninsular Malaysia, is herewith described and illustrated. It is related to R. azlanii and R. sharifah-hapsahiae by coalesced warts on it lobes. Rafflesia tuanku-halimii is different from them in having window covered by almost united rings and these rings almost wholly covering the window