Yeast and filamentous fungi microbial communities in organic red grape juice : effect of vintage, maturity stage, SO2, and bioprotection

Changes are currently being made to winemaking processes to reduce chemical inputs [particularly sulfur dioxide (SO2)] and adapt to consumer demand. In this study, yeast growth and fungal diversity were investigated in merlot during the prefermentary stages of a winemaking process without addition of SO2. Different factors were considered, in a two-year study: vintage, maturity level and bioprotection by the adding yeast as an alternative to SO2. The population of the target species was monitored by quantitative-PCR, and yeast and filamentous fungi diversity was determined by 18S rDNA metabarcoding. A gradual decrease of the α-diversity during the maceration process was highlighted. Maturity level played a significant role in yeast and fungal abundance, which was lower at advanced maturity, while vintage had a strong impact on Hanseniaspora spp. population level and abundance. The presence of SO2 altered the abundance of yeast and filamentous fungi, but not their nature. The absence of sulfiting led to an unexpected reduction in diversity compared to the presence of SO2, which might result from the occupation of the niche by certain dominant species, namely Hanseniaspora spp. Inoculation of the grape juice with non-Saccharomyces yeast resulted in a decrease in the abundance of filamentous fungi generally associated with a decline in grape must quality. Lower abundance and niche occupation by bioprotection agents were observed at the overripened stage, thus suggesting that doses applied should be reconsidered at advanced maturity. Our study confirmed the bioprotective role of Metschnikowia pulcherrima and Torulaspora delbrueckii in a context of vinification without sulfites

Population dynamics and yeast diversity in early winemaking stages without sulfites revealed by three complementary approaches

Nowadays, the use of sulfur dioxide (SO2 ) during the winemaking process is a controversial societal issue. In order to reduce its use, various alternatives are emerging, in particular bioprotection by adding yeasts, with different impacts on yeast microbiota in early winemaking stages. In this study, quantitative-PCR and metabarcoding high-throughput sequencing (HTS) were combined with MALDI-TOF-MS to monitor yeast population dynamic and diversity in the early stages of red winemaking process without sulfites and with bioprotection by Torulaspora delbrueckii and Metschnikowia pulcherrima addition. By using standard procedures for yeast protein extraction and a laboratory-specific database of wine yeasts, identification at species level of 95% of the isolates was successfully achieved by MALDI-TOF-MS, thus confirming that it is a promising method for wine yeast identification. The different approaches confirmed the implantation and the niche occupation of bioprotection leading to the decrease of fungal communities (HTS) and Hanseniaspora uvarum cultivable population (MALDI-TOF MS). Yeast and fungi diversity was impacted by stage of maceration and, to a lesser extent, by bioprotection and SO2, resulting in a modification of the nature and abundance of the operational taxonomic units (OTUs) diversity

Non-Saccharomyces yeasts as bioprotection in the composition of red wine and in the reduction of sulfur dioxide

Non-Saccharomyces yeasts have been used for many years due to their technological potential, particularly as a « booster » of wine fruity aroma in mixed fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Recently, a new application has emerged, bioprotection, which consists in colonizing the environment in the context of sulfite reduction in wines. The chemical and sensory impact of non-Saccharomyces yeast according to different modes of application in a context of fermentation without addition of SO2 was evaluated through trial with Merlot N. (Vitis vinifera L.). An effective niche occupation by non-Saccharomyces yeasts was highlighted during the prefermentary stages by Quantitative-PCR and MALDI-TOF MS identification. Chemical analysis (GC-MS and GC MS/MS) of finish wine showed the significant impact of the dose applications, with bioprotection characterized by linear esters and sequential application by acetates of higher alcohol contents. Moreover, a separation according to the species used in bioprotection was revealed. Finally, using a panel trained, the sensory analysis confirmed that the use of non-Saccharomyces yeast was a fruity booster in sequential inoculation and, to a less extent, when used as bioprotection. This study shows for the first time that the use of non-Saccharomyces yeast as a bioprotection has a significant impact on the aromatic profile of wines

La réduction des sulfites en vinification et l’utilisation de levures à activité bioprotectrice : approche microbiologique, chimique et sensorielle

Chemical preservatives in agri-food products are source of controversy, and oenology is no exception, especially with sulfur dioxide (SO2). This adjutant has been used for many years during the winemaking process for its antimicrobial, antioxidant and antioxydasic properties. Facing societal expectations and norm problems, winemakers are committed to produce wines with low sulfite or even zero sulfite contents. For winemakers, doing without it remains a risky decision, for which consequences on the fermentation process, the chemical and sensory characteristics remain poorly explored. The addition of non-Saccharomyces yeast as a bioprotection is currently considered as an alternative to the first sulfiting. This work aims to assess the consequences of removing sulfiting and using bioprotection, on the microbial diversity of prefermentary and fermentation stages, as well as on the chemical and sensory composition of wines.Without sulfiting, the populations of Metschnikowia pulcherrima and Hanseniaspora spp. increase during the prefermentary stages and the diversity indices are significantly lower due to the colonization of the environment by certain species, notably Hanseniaspora in red grape musts. In addition, sulfur dioxide mainly affects the fungal and yeast community according to OTUs abundance but also the diversity of native Saccharomyces cerevisiae strains, especially in white musts. The two species used in bioprotection, Torulaspora delbrueckii and to a lower extent Metschnikowia pulcherrima, colonize the grape must during the prefermentary stages, with a decrease of the relative abundances of fungal communities in comparison with the control without SO2, due probably to phenomena of competition to occupy the environment. This colonization effect is less important for over-ripened harvests. On the other hand, no negative effects are observed on Hanseniaspora spp. population levels.Under our experimental conditions in white must, absence of SO2 leads to oxidation of flavonoids in the must, an important color evolution and a lower glutathione concentration in the final white wines. The two bioprotection species consume oxygen in the grape must, which allows partial protection against oxidation and at the same time limiting acetic bacteria development. A preliminary study based on metabolomics analyzes shows significant differences between red wines without sulfites and wines produced with classic sulfiting at the vatting stage. From a sensory perspective, cooked black cherries notes and a freshness perception on the nose and in the mouth characterizes wines without SO2, while the sulfite wines are correlated with smoky notes. Finally, the early use of non-Saccharomyces yeasts in bioprotection significantly affects the chemical characteristics of wines with an increase of the fruity character of young wines at the sensory level, which nevertheless remains limited compared to the use of the same strains in mixed fermentation with Saccharomyces cerevisiae.L’utilisation de conservateur chimique dans les produits agro-alimentaires est source de controverse, et l’œnologie n’en fait pas l’exception notamment avec le dioxyde de soufre (SO2). Cet adjudant est utilisé depuis de nombreuses années au cours du processus de vinification pour ses propriétés antimicrobiennes, antioxydantes et antioxydasiques. Face aux attentes sociétales et aux problèmes de normes, les viticulteurs s’engagent vers la production de vins à faibles teneurs en sulfites voire zéro sulfites. Pour les praticiens, s’en détacher demeure d’une décision hasardeuse et dont les conséquences sur la conduite des fermentations et les caractéristiques chimiques et sensorielles des vins restent peu connues. L’ajout de levure non-Saccharomyces en tant que bioprotection est considéré actuellement comme alternative au premier sulfitage. Ce travail a pour objectifs d’évaluer les conséquences de la suppression du sulfitage et de l’utilisation de la bioprotection sur la communauté microbienne des phase préfermentaires et fermentaires, mais également sur la composition chimique et sensorielle des vins.En absence de sulfitage, les populations de Metschnikowia pulcherrima et de Hanseniaspora spp augmentent pendant la phase préfermentaire et les indices de diversité sont significativement plus faibles du fait de la colonisation du milieu par certaines espèces, notamment Hanseniaspora dans les moûts rouges. De plus, le dioxyde de soufre impacte principalement la communauté fongique et levure du point de vue de l’abondance des OTUs mais également la diversité des souches indigènes de S. cerevisiae en particulier dans le cas des moûts blancs. Les deux espèces utilisées en bioprotection, Torulaspora delbrueckii et dans une moindre mesure Metschnikowia pulcherrima s’implantent dans le moût de raisin au cours des étapes préfermentaires, avec pour conséquences une forte diminution des abondances relatives des communautés fongiques en comparaison avec le témoin sans SO2 probablement du fait de phénomènes de compétition vis-à-vis de l’occupation du milieu. Cet effet occupation de la niche est moins important dans le cas de vendanges à maturité avancée. En revanche, aucun effet négatif n’est observé sur les niveaux de populations de Hanseniaspora spp. Dans nos conditions expérimentales en blanc, l’absence de SO2 entraine une oxydation des flavonoïdes dans le moût, une évolution de la couleur et une concentration en glutathion plus faible dans les vins blancs finis. Les deux espèces utilisées en tant que bioprotection consomment l’oxygène dans le moût de raisin permettant ainsi une protection partielle vis-à-vis de l’oxydation tout en limitant le développement des bactéries acétiques. Une étude préliminaire basée sur des analyses métabolomiques montrent que la composition des vins rouges sans sulfites est significativement différente de celle des vins élaborés avec un sulfitage classique à l’encuvage. D’un point de vue sensoriel, les vins sans sulfites sont caractérisés par des notes de cerises noires cuites et une perception de fraicheur au nez et en bouche alors que les vins sulfités sont corrélés à des notes de fumée. Enfin, l’utilisation précoce des levures non-Saccharomyces en bioprotection impacte significativement les caractéristiques chimiques des vins avec, au niveau sensoriel, une augmentation du caractère fruité des vins jeunes qui reste néanmoins limitée par rapport à l’utilisation des mêmes souches en fermentation mixe avec Saccharomyces cerevisiae

The reduction of sulphites in winemaking process and the use of yeasts with bio-protective activity : microbiological, chemical and sensory approach

L’utilisation de conservateur chimique dans les produits agro-alimentaires est source de controverse, et l’œnologie n’en fait pas l’exception notamment avec le dioxyde de soufre (SO2). Cet adjudant est utilisé depuis de nombreuses années au cours du processus de vinification pour ses propriétés antimicrobiennes, antioxydantes et antioxydasiques. Face aux attentes sociétales et aux problèmes de normes, les viticulteurs s’engagent vers la production de vins à faibles teneurs en sulfites voire zéro sulfites. Pour les praticiens, s’en détacher demeure d’une décision hasardeuse et dont les conséquences sur la conduite des fermentations et les caractéristiques chimiques et sensorielles des vins restent peu connues. L’ajout de levure non-Saccharomyces en tant que bioprotection est considéré actuellement comme alternative au premier sulfitage. Ce travail a pour objectifs d’évaluer les conséquences de la suppression du sulfitage et de l’utilisation de la bioprotection sur la communauté microbienne des phase préfermentaires et fermentaires, mais également sur la composition chimique et sensorielle des vins.En absence de sulfitage, les populations de Metschnikowia pulcherrima et de Hanseniaspora spp augmentent pendant la phase préfermentaire et les indices de diversité sont significativement plus faibles du fait de la colonisation du milieu par certaines espèces, notamment Hanseniaspora dans les moûts rouges. De plus, le dioxyde de soufre impacte principalement la communauté fongique et levure du point de vue de l’abondance des OTUs mais également la diversité des souches indigènes de S. cerevisiae en particulier dans le cas des moûts blancs. Les deux espèces utilisées en bioprotection, Torulaspora delbrueckii et dans une moindre mesure Metschnikowia pulcherrima s’implantent dans le moût de raisin au cours des étapes préfermentaires, avec pour conséquences une forte diminution des abondances relatives des communautés fongiques en comparaison avec le témoin sans SO2 probablement du fait de phénomènes de compétition vis-à-vis de l’occupation du milieu. Cet effet occupation de la niche est moins important dans le cas de vendanges à maturité avancée. En revanche, aucun effet négatif n’est observé sur les niveaux de populations de Hanseniaspora spp. Dans nos conditions expérimentales en blanc, l’absence de SO2 entraine une oxydation des flavonoïdes dans le moût, une évolution de la couleur et une concentration en glutathion plus faible dans les vins blancs finis. Les deux espèces utilisées en tant que bioprotection consomment l’oxygène dans le moût de raisin permettant ainsi une protection partielle vis-à-vis de l’oxydation tout en limitant le développement des bactéries acétiques. Une étude préliminaire basée sur des analyses métabolomiques montrent que la composition des vins rouges sans sulfites est significativement différente de celle des vins élaborés avec un sulfitage classique à l’encuvage. D’un point de vue sensoriel, les vins sans sulfites sont caractérisés par des notes de cerises noires cuites et une perception de fraicheur au nez et en bouche alors que les vins sulfités sont corrélés à des notes de fumée. Enfin, l’utilisation précoce des levures non-Saccharomyces en bioprotection impacte significativement les caractéristiques chimiques des vins avec, au niveau sensoriel, une augmentation du caractère fruité des vins jeunes qui reste néanmoins limitée par rapport à l’utilisation des mêmes souches en fermentation mixe avec Saccharomyces cerevisiae.Chemical preservatives in agri-food products are source of controversy, and oenology is no exception, especially with sulfur dioxide (SO2). This adjutant has been used for many years during the winemaking process for its antimicrobial, antioxidant and antioxydasic properties. Facing societal expectations and norm problems, winemakers are committed to produce wines with low sulfite or even zero sulfite contents. For winemakers, doing without it remains a risky decision, for which consequences on the fermentation process, the chemical and sensory characteristics remain poorly explored. The addition of non-Saccharomyces yeast as a bioprotection is currently considered as an alternative to the first sulfiting. This work aims to assess the consequences of removing sulfiting and using bioprotection, on the microbial diversity of prefermentary and fermentation stages, as well as on the chemical and sensory composition of wines.Without sulfiting, the populations of Metschnikowia pulcherrima and Hanseniaspora spp. increase during the prefermentary stages and the diversity indices are significantly lower due to the colonization of the environment by certain species, notably Hanseniaspora in red grape musts. In addition, sulfur dioxide mainly affects the fungal and yeast community according to OTUs abundance but also the diversity of native Saccharomyces cerevisiae strains, especially in white musts. The two species used in bioprotection, Torulaspora delbrueckii and to a lower extent Metschnikowia pulcherrima, colonize the grape must during the prefermentary stages, with a decrease of the relative abundances of fungal communities in comparison with the control without SO2, due probably to phenomena of competition to occupy the environment. This colonization effect is less important for over-ripened harvests. On the other hand, no negative effects are observed on Hanseniaspora spp. population levels.Under our experimental conditions in white must, absence of SO2 leads to oxidation of flavonoids in the must, an important color evolution and a lower glutathione concentration in the final white wines. The two bioprotection species consume oxygen in the grape must, which allows partial protection against oxidation and at the same time limiting acetic bacteria development. A preliminary study based on metabolomics analyzes shows significant differences between red wines without sulfites and wines produced with classic sulfiting at the vatting stage. From a sensory perspective, cooked black cherries notes and a freshness perception on the nose and in the mouth characterizes wines without SO2, while the sulfite wines are correlated with smoky notes. Finally, the early use of non-Saccharomyces yeasts in bioprotection significantly affects the chemical characteristics of wines with an increase of the fruity character of young wines at the sensory level, which nevertheless remains limited compared to the use of the same strains in mixed fermentation with Saccharomyces cerevisiae

Int J Food Microbiol

Bioprotection by yeast addition is increasingly used in oenology as an alternative to sulfur dioxide (SO2). Recent studies have also shown that it is likely to consume dissolved O2. This ability could limit O2 for other microorganisms and the early oxidation of the grape must. However, the ability of yeasts to consume O2 in a context of bioprotection was poorly studied so far considering the high genetic diversity of non-Saccharomyces. The first aim of the present study was to perform an O2 consumption rate (OCR) screening of strains from a large multi species collection found in oenology. The results demonstrate significant inter and intra species diversity with regard to O2 consumption. In the must M. pulcherrima consumes O2 faster than Saccharomyces cerevisiae and then other studied non-Saccharomyces species. The O2 consumption was also evaluate in the context of a yeast mix used as industrial bioprotection (Metschnikowia pulcherrima and Torulaspora delbrueckii) in red must. These non- Saccharomyces yeasts were then showed to limit the growth of acetic acid bacteria, with a bioprotective effect comparable to that of the addition of sulfur dioxide. Laboratory experiment confirmed the negative impact of the non-Saccharomyces yeasts on Gluconobacter oxydans that may be related to O2 consumption. This study sheds new lights on the use of bioprotection as an alternative to SO2 and suggest the possibility to use O2 consumption measurements as a new criteria for non-Saccharomyces strain selection in a context of bioprotection application for the wine industry

Bioprotection as an alternative to SO₂ in the pre-fermentation phase

Additives have been used in the food industry for many years, to prevent food spoilage and extend shelf life. These chemical additives are a source of controversy and their use must be reduced in the face of societal demand. In enology, this applies in particular to sulfur dioxide (SO2). There has been recent research on bioprotection as an alternative to sulfite addition in the pre-fermentation phase. This technical article discusses the many advantages of using bioprotection agents

La bioprotection en œnologie: Impacts microbiologiques et conséquences œnologiques

Article de revue professionnelleLa bioprotection est définie comme un procédé visant à appliquer un microorganisme vivant dans le but de coloniser le milieu dans lequel il est ensemencé, afin de limiter le développement d’une flore non qualitative et les altérations qu’elle génère. Dans la pratique, il s’agit très souvent de levures de type non-Saccharomyces. Ce terme regroupe en réalité un ensemble très hétérogène de genres et d’espèces dont nombre d’entre eux sont délétères à la qualité du vin. Le choix du microorganisme doit donc reposer à la fois sur des critères liés à l’espèce (faiblement fermentaire mais ayant la capacité de se maintenir dans le moût ; ne générant pas de défauts), mais aussi à la souche puisqu’au sein de la première, il existe une grande variabilité. De plus, la diversité des contextes œnologiques dans lesquels les agents de bioprotection sont utilisés constitue un paramètre supplémentaire à prendre en compte lors de leur sélection et leur mise en œuvre : les microorganismes choisis doivent être suffisamment robustes pour s’adapter à nombre de situations. Ici, il sera fait mention d’un mélange de deux souches, l’une provenant de l’espèce Torulaspora delbrueckii, l’autre de l’espèce Metschnikowia pulcherrima, ce qui nous a semblé être la solution optimale pour répondre à l’ensemble de ces contraintes. L’utilisation d’agents de bioprotection s’inscrit principalement (mais pas seulement) dans un contexte de diminution du SO2 et pour l’instant s’applique uniquement sur vendange et sur moût. En effet, les vinificateurs cherchent depuis quelques années à limiter et même bannir l’utilisation du dioxyde de soufre lors du processus de vinification. Néanmoins, les données scientifiques sur les mécanismes exacts qui sous-tendent l’application de la bioprotection et ses conséquences œnologiques sont encore trop rares