In silico and in vivo screening of triamterene synthetic analogues as promising diuretics

The modification of lead-compound aimed to the increasing of activity, decrement of toxicity or improvement of selectivity is one of the most important methods used for elaboration of novel medications. Natural compounds, approved or investigational drugs or just compounds with proved biological activity could be the lead-compound. Often the chemical modification of lead compounds is directed at the enhancement of ligand-biological target interactions. Abovementioned approach, namely structural modification of known drug triamterene was used for purposeful search for novel diuretics. The preliminary prognostication of ligand-target interactions and affinity levels allow to reduce quantity of experimental animals, synthesis, and pharmacological studies costs. Conducted studies revealed the series of promising 6,7-disubstituted pteridine-2,4(1H,3H)-diones with diuretic activity that comparable with pharmacological effect of triamterene. Aim – purposeful search for promising diuretics among structural analogues of triamterene that includes preliminary in silico studies, synthesis and in vivo screening of novel compounds for diuretic activity. Methods used: organic synthesis, physicochemical methods of analysis of organic compounds (NMR 1 H-spectroscopy, chromato-mass spectrometry, elemental analysis). Prediction of affinity for a biological target, prediction of toxicity and lipophilicity of the combinatorial library, which was created on the basis of the drug triamterene, was carried out using computer services. Studies of compounds that affect the excretory function of the kidneys of rats were performed according to the generally accepted method of E.B. Berkhin with water load. Research of the probable mechanism was conducted by flexible molecular docking, as an approach of finding molecules with affinity to a specific biological target. Macromolecular data were downloaded from the Protein Data Bank (PDB) namely, the crystal structures of epithelial sodium channel (ENaC) ((PDB ID – 6WTH). The substantiation of potential diuretics design was conducted by in silico methods (prediction of affinity, ligandenzyme interactions and pharmacokinetic characteristics). The structural modification of triamterene molecule was carried out by replacing of amino-group in positions 2, 4 and 7 by others “pharmacophore” fragments. Abovementioned transformation is aimed at the changing of ligand-enzyme interactions in active site, lipophility and toxicity. Synthesis of 6,7- disubstituted pteridine-2,4(1H,3H)-diones was conducted by condensation 5,6-diamino-2-oxo-(thioxo-)-2,3-dihydropyrimidin4(1H)-ones with carbonyl-containing compounds or oxocarboxylic acids. The further modification of obtained compounds was performed by alkylation, hydrazinolysis and nucleophilic addition/elimination. The structure of obtained compounds was proven by elemental analysis, chromato-mass and 1 H NMR-spectral analysis. The studies of synthesized compounds effect on excretion function of kidneys allowed to detect series of promising structural analogues of triamterene that exceed it in pharmacological activity by 27.3-99.0%. The “structure-biological activity” relationship was discussed and perspective of the further search of diuretics among abovementioned compounds were shown. The design of new biologically active compounds with diuretic activity was performed using in silico methodologies and realized by structural modification of the well-known diuretic triamterene. Traditional organic synthesis was used for preparation of target compounds, in vivo experiments wereused to detect compounds with significant biological activity. Several effective compounds were identified among pteridines, which exceed the reference drug triamterene in terms of daily diuresis. The obtained results substantiate further purposeful search, in-depth research on experimental pathologies and study of the mechanism of action of potential diuretics among this class of compound

ЗАМІЩЕНІ 3-R-7,8-ДИГІДРО-2Н-ПІРОЛО[1,2-а][1,2,4]ТРИАЗИНО[2,3-с]ХІНАЗОЛІН-5а(6Н)-АЛКІЛКАРБОНОВІ КИСЛОТИ – ПЕРСПЕКТИВНИЙ КЛАС МАЛОТОКСИЧНИХ ПРОТИЗАПАЛЬНИХ АГЕНТІВ

The aim of the work. Evaluation of the anti-inflammatory activity and acute toxicity of new 3-R-7,8-dihydro-2H-pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolin-5a (6H)-alkyl-carboxylic acids as potential anti-inflammatory agents. Materials and Methods. The study of anti-inflammatory activity was conducted on a model of carrageenan-induced paw edema on white male Wistar rats weighing 140- 220 g. The tested compounds were administered orally using an atraumatic probe at a dose of 25 mg/kg, sodium diclofenac was used as reference drug and was administrated in dose 10 mg/kg. The acute toxicity of the studied compounds was predicted by in silico methods (GUSAR and TEST software packages), as well, as evaluated experimentally on outbred white mice of both sexes weighing 16-24 g. The synthesized compounds were administered intraperitoneally in the form of a fine suspension in physiological saline, which was stabilized by Tween 80. Median lethal doses (LD50) were determined by the Prozorovsky method. Statistical processing was conducted by appropriate approaches using the STATISTICA® for Windows 6.0 software (StatSoft Inc, No. AXXR712D833214FAN5). Results and Discussion. The study of the anti-inflammatory activity of pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolines derivatives showed that the studied compounds are highly active anti-inflammatory agents, that compete or exceed activity of reference drug “Sodium diclofenac”. The most active was 3-(3-methyl-2,8-dioxo-7,8-dihydro-2H-pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolin-5a(6H)-yl)propanoic acid (5) which by the level of pharmacological effect exceeded reference drug by more than 20%. The results of in silico and in vivo study of the pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazoline derivatives acute toxicity showed their mutual correlation. Intraperitoneal administration of the studied compounds to white mice at doses of 500 to 1500 mg/kg allowed assign them to toxicity classes IV and V (low-toxic and practically non-toxic compounds, respectively, classification of toxicity with parenteral routes of administration). Conclusion. The anti-inflammatory activity and acute toxicity of new pyrrolo[1,2-a][1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolines were studied. It was found that most of the studied compounds exhibit significant anti-inflammatory activity being low-toxic or practically non-toxic (IV-V class). “Chemical structure – anti-inflammatory activity” relationship analysis showed, that the introduction of propanoic acid moiety in position 5a may be considered as rational approach for search for new anti-inflammatory agents. Described compounds are a promising group for further purposeful synthesis and in-depth pharmacological studies aimed at creating new non-steroidal anti-inflammatory drugs.Мета роботи. Дослідження протизапальної активності та гострої токсичності оригінальних 3-R-7,8-дигідро-2Н-піроло[1,2-а][1,2,4]триазино[2,3-с]хіназолін-5а(6Н)-алкілкарбонових кислот. Матеріали і методи. Дослідження протизапальної активності проводили на моделі карагенінового набряку лапки білих щурів-самців лінії «Вістар» масою 140 – 220 г. Досліджувані речовини вводили перорально у вигляді водної суспензії, стабілізованої Твіном 80, за допомогою атравматичного зонда в дозі 25 мг/кг, натрію диклофенак – 10 мг/кг. Показники гострої токсичності досліджуваних сполук було спрогнозовано in silico (програмні пакети GUSAR і TEST) та встановлено in vivo на білих безпородних мишах обох статей масою 16 – 24 г. Синтезовані сполуки вводили одноразово внутрішньоочеревинно у вигляді тонкої суспензії у фізіологічному розчині, стабілізованої Твіном 80. Середньолетальні дози (ЛД50) визначали за методом В. Прозоровського. Статистичну обробку даних проводили за загальноприйнятими підходами за допомогою статистичного пакета програм «STATISTICA® for Windows 6.0» (StatSoft Inc, № АХХR712D833214FAN5). Результати й обговорення. Вивчення протизапальної дії похідних піроло[1,2-a][1,2,4]триазино[2,3-c]хіназоліну показало, що досліджувані сполуки є високоактивними протизапальними агентами, які за рівнем дії конкурують або перевищують препарат порівняння «Натрію диклофенак». Найбільш активною виявилась 3-(3-метил-2,8-діоксо-7,8-дигідро-2H-піроло[1,2-a][1,2,4]триазино[2,3-c]хіназолін-5a(6H)-іл)пропанова кислота (5), яка за рівнем дії перевищує препарат порівняння більше ніж на 20 %. Результати вивчення гострої токсичності похідних піроло[1,2-a][1,2,4]триазино[2,3-c]хіназолінів, проведені методами in silico та in vivo, корелюють поміж собою. Внутрішньоочеревинне введення досліджуваних сполук білим безпородним мишам у дозах від 500 до 1500 мг/кг дозволило віднести їх до IV та V класу токсичності (малотоксичні та практично нетоксичні сполуки, згідно із класифікацією токсичності при парентеральних способах введення). Висновки. Досліджено протизапальну активність та гостру токсичність серед оригінальних піроло[1,2-а][1,2,4]триазино[2,3-с]хіназолінів і встановлено, що більшість досліджуваних сполук проявляють виражену протизапальну дію при внутрішньошлунковому введенні та належать до практично нетоксичних або малотоксичних сполук (IV-V клас). Обговорено взаємозв’язок «хімічна будова – протизапальна активність» і показано, що введення залишку пропанової кислоти в положення 5а зазначеної системи є виправданим у плані пошуку сполук з антиексудативною дією, а зазначені структури є перспективною групою для проведення подальшого спрямованого синтезу і фармакологічних досліджень із метою створення на їх основі нових нестероїдних протизапальних засобів