Criopreservação de mórulas de camundongos em glicerol, sacarose e geléia real

Compacted mouse morulae were frozen at 0.3ºC/min. or 0.5ºC/min. from -6ºC to -24ºC or -32ºC in 10% of glycerol plus different sucrose concentrations with or without 0.1% of honeybee royal jelly. Embryos were thawed in water bath at 22ºC for 20 seconds and cryoprotectant dilution was done in three steps. Embryos were cultured in Whittens medium for 24, 48 and 72 hours at 37ºC, 5% of CO2 and 100% of humidity. The in vitro development ranged from 56.6% to 100% after 72 hours. Expanded blastocysts were transferred to pseudopregnant recipients on the third day of the estrous cycle. Viable fetuses rates for embryos frozen to -24 or -32ºC at 0.3ºC/minute in 10% glycerol + 10% sucrose, 10% glycerol + 10% sucrose + 0.1% honeybee royal jelly, 10% glycerol + 0.1% honeybee royal jelly or 10% glycerol were respectively: 28.1% and 13.6%, 48.7% and 31.9%, 28.6% and 13.2%, 20.0% and 42.4%. Viable fetuses for embryos frozen to -24ºC or -32ºC at 0.5ºC/minute in 10% glycerol + 10% sucrose or 10% glycerol + 10% sucrose + 0.1% honeybee royal jelly were respectively 29.0% and 15.3%, 48.8% and 32.0%. We can conclude that addition of 10% sucrose to 10% glycerol was efficient for embryo freezing at 0.3 or 0.5ºC/minute and plunged in liquid nitrogen at -24ºC. The honeybee royal jelly addition provided higher viable fetuses rates when embryos were cooled at 0.3 or 0.5ºC/minute and plunged in liquid nitrogen at -24ºC.Embriões de camundongos foram congelados em 10% de glicerol adicionado de várias concentrações de sacarose e/ou 0,1% de geléia real, nas velocidades de 0,3ºC ou 0,5ºC/minuto até -24ºC ou -32ºC e descongelados em água a 22ºC durante 20 segundos. A diluição dos crioprotetores foi realizada em três etapas e o cultivo dos embriões no meio de Whitten em estufa com 5% de CO2, 100% de umidade e 37ºC por 72 horas. O desenvolvimento in vitro até blastocisto variou entre 56,6% e 93,4%, mostrando que 10% de sacarose + 10% de glicerol foi eficiente na congelação. Blastocistos expandidos oriundos de embriões congelados até -24 ou -32ºC à velocidade de 0,3ºC/minuto em soluções contendo 10% de glicerol + 10% de sacarose; 10% de glicerol + 10% de sacarose + 0,1% de geléia real; 10% de glicerol + 0,1% de geléia real ou 10% de glicerol, transferidos para receptoras pseudoprenhes, apresentaram, respectivamente, taxas de fetos viáveis de 28,1% e 13,6%, 48,7% e 31,9%, 28,6% e 13,2%, 20,0% e 42,4%. Embriões congelados até -24ºC ou -32ºC a 0,5ºC/minuto nas soluções de 10% de glicerol + 10% de sacarose ou 10% de glicerol + 10% de sacarose + 0,1% de geléia real apresentaram, respectivamente, taxas de fetos viáveis de 29,0% e 15,3%, 48,8% e 32,0%. Adição de sacarose e de geléia real ao meio de congelação contendo 10% de glicerol proporcionou maiores taxas de fetos viáveis a 0,3ºC e 0,5ºC/minuto e imersão em nitrogênio líquido a -24ºC

Superovulação em caprinos da raça Moxotó com FSH-p

The aim of the work was to evaluate the rates of estrous, superovulatory response and embryos recovery in Moxotó goats after three treatments with porcine FSH. Twenty goats were synchronised with medroxyprogesterone acetate sponges (60 mg for 11days) and cloprostenol (l00 mug on ninth day). The animals were superovulated with 250 IU of FSH-p in 8 decreasing doses at intervals of 12 hours. The repetition of superovulatory treatment decreased estrous symptoms, but didnt affect the ovulation rate and decreased the regressed corpus luteum rate. The embryos recovery was affected by regressed corpus luteum and embryo collection technique.O objetivo deste trabalho foi avaliar as taxas de manifestação de sintomas de estro, de resposta superovulatória e de recuperação de embriões em 20 cabras da raça Moxotó em três tratamentos consecutivos, em intervalos de 56 dias. O ciclo estral das fêmeas foi sincronizado com esponjas vaginais contendo 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (MGA) durante 11 dias e com 100 mig de cloprostenol (PGF2alfa ) administrado no nono dia. Neste dia, iniciou-se o tratamento superovulatório com 250 UI de FSH-p por cabra, fracionadas em oito doses decrescentes, com intervalo de 12 horas. A repetição do tratamento superovulatório com FSH-p diminuiu a taxa de manifestação de sintomas de estro, porém não afetou a taxa de ovulação e reduziu a taxa de regressão prematura de corpos lúteos. A taxa de recuperação de embriões foi influenciada pela ocorrência de regressão prematura de corpos lúteos e pela ação das repetidas colheitas de embriões sobre o genital. Não foi possível avaliar o efeito das repetidas superovulações sobre a taxa de recuperação de embriões

Seminal characteristics of German Shepherd dogs

Sêmen de 25 cães da raça Pastor Alemão, com 1 a 7 anos de idade e pesando 30 a 35 quilos, foi coletado por masturbação. Com o objetivo de utilizar o material para inseminação artificial, colheu-se a segunda e parte da terceira fração, constatando-se, em média, volume de 7,17 ml; cor branca e aspecto leitoso; motilidade de 68,84%; vigor de 3,5; concentração de 136.192 espermatozóides por mm3 e de 889.772.000 por ejaculado; defeitos espermáticos maiores de 9,92% e menores de 7,62%. O pH do sêmen, dos diluidores e do sêmen diluído variou, respectivamente, de 6,02 a 6,60; 5,85 a 6,90; e 5,97 a 6,76; a pressão osmótica de 285,20 a 295,00; 240,00 a 310,00; e 272,32 a 303,92 mOsmois e a concentração de sódio e potássio, respectivamente, para o plasma seminal e os 4 diluidores, de 134,40 a 156,00; 7,80 a 13,72; 3,00 a 270,00; e 6,00 a 25,00 mEq/l. Verificou-se que entre cães, houve variação significante de todas as características seminais, exceto a pressão osmótica e, ainda, correlações entre os caracteres seminais e entre estes e os totais de patologias espermáticas. A variabilidade das características seminais entre os cães foi bem maior quando comparada entre as colheitas de cada animal, exceto a pressão osmótica e a concentração de sódio, que se apresentaram de maneira inversa.Semen was collected by masturbation from 25 German Shepherd dogs, 1 to 7 years old and weight from 30 to 35 kg. Aiming to utilize the semen for artificial insemination, only the second and partial third fractions were used. Results were as follows: mean ejaculation volume 7.17 ml; white colour and milky aspect: sperm motility 68.84%; vigour 3.5; concentration 136.192 spermatozoa/mm3 and 889.772.000 spermatozoa by ejaculation: 9.92% of major defects, 7.62% of minor defects and still an individual abnormalities classification. The pH of semen, of extenders and of extended semen, respectively, varied from 6.02 to 6.60; 5.85 to 6.90 and 5.97 to 6.76: osmotic pressure of 285.20 to 295.00; 240.00 to 310.00 and 272.32 to 303.92 mOlm and sodium and potassium concentrations, respectively, to seminal plasma and 4 extenders, 134.40 to 156.00 and 7.80 to 13.72 and 3.00 to 270.00 and 6.00 to 25.00 mEq/l. There was significant variation among dogs, in all seminal characteristics, except for osmotic pressure. There was also correlation between the seminal characteristics and between these and total sperm abnormalities. Variability of seminal characteristics among dogs is greater when comparing collections of each animal, with exception of osmotic pressure and sodium concentration variability that is reversed

Efeito da suplementação da dieta com óleo de babaçu sobre a composição do sangue e leite de éguas em lactação

The effect of dietary supplementation with coconut oil (CO) with four levels (0, 4, 8 and 16%) on the variation of blood and milk composition of lactating mares were investigated. Sixteen lactating mares were used with average live weight of 441.2 kg. Mares were supplemented with 1,5% of live weight with concentrate composed of corn meal, wheat bran and soybean meal with 16% crude protein. Forage was Napier grass and mineral supplement and water supplied "ad libitum". Mares were allotted to 16 pens (4x5m) and randomly assigned to receive each of four diets once a day during 42 days. Samples of blood (50 ml) were collected for analysis of triglycerides and cholesterol. Samples of milk (250 ml) were collected manually for analyses of acidity, fat and cholesterol. At the end of the experiment the supplementation with CO showed respectively for blood: triglycerides, 24; 32; 28 and 25 mg dl-1; cholesterol, 107; 136; 126 and 129 mg dl-1 and for milk: acidity, 10; 9; 8 and 7 ºD; fat, 0,6; 1,1; 0,9 and 0,9%. Cholesterol in the fat of the milk, 366.5; 308.6; 447.9 and 491.0 mg.100g-1. The supplementation with CO, increased the triglycerides levels and plasmatic cholesterol, with linear effect; they reduced the level of acidity and increased fat content of milk with linear effect and they had no effect on cholesterol content in the milk.Foi investigada a suplementação de dietas com óleo de babaçu nos níveis de (0, 4, 8 e 16%) na composição do sangue e leite de éguas em lactação. Utilizaram-se 16 éguas em lactação, sem raça definida com peso vivo médio de 441,2 kg. As éguas foram suplementadas com 1,5% do peso vivo com uma mistura composta de quirera de milho, farelo de trigo e farelo de soja com 16% de proteína bruta. A água e o volumoso constituído de Napier e suplemento mineral, foram oferecidos ad libitum. Colocadas em baias individuais com 4 x 5m as éguas recebiam as dietas tratamento uma vez ao dia.Elas foram alimentadas durante 42 dias. Coletaram-se amostras de 50 ml de sangue para análise de triglicerídeos e colesterol total e 250 ml de leite colhido manualmente para as análises de acidez, teor de gordura e colesterol. O sangue apresentou, ao término do experimento, os seguintes teores: triglicerídeos (24, 32, 28 e 25 mg dl-1), colesterol (107, 136, 126 e 129 mg dl-1 ) e para o leite, os teores encontrados foram: (acidez 10, 9, 8 e 7 ºD), gordura (0,6; 1,1; 0,9 e 0,9 %), colesterol na gordura do leite (366,5; 308,6; 447,9 e 491,0 mg.100g-1). A suplementação com óleo de babaçu aumentou os níveis de triglicerídeos e colesterol plasmáticos com efeito linear. Quanto ao leite, diminuiu o teor de acidez e aumentou os teores de gordura com efeito linear, mas não afetou o teor de colesterol

Lipid structural information from a single equine embryo by MALDI-MS

O objetivo deste trabalho foi relatar o potencial da técnica de MALDI-MS para caracterizar espécies de lipídios presentes em um único embrião equino e estudar algumas estruturas lipídicas detectadas por dissociação induzida por colisão (CID). No espectro de modo íon positivo, pudemos observar espécies, principalmente, protonadas e sodiadas de esfingomielinas (SM), fosfatidileolinas (PC) e triacilgliceróis (TAG). No modo negativo, observamos fosfatidiletanolaminas (PE) e fosfatidilinositos (PI). Espectros de íons de lípidos com maior intensidade foram utilizados para demonstrar o potencial da informação estrutural por MALDI-MS/MS. O espectro no modo positivo de m/z (massa sobre carga) 760,6 (atribuída como PC34:1) apresentou características de fragmentos PC de m/z 184,1 (denominada cabeça polar de colina), além de perda neutral (NL) de m/z 183 (fosforilcolina). Para o íon de m/z 766,6 (atribuída como PE38:5), observou-se a NL de 140, característica do PE. Para o íon de m/z 808,7 (38,5 atribuído como PC), além do fragmento m/z 184,1 na NL de 183, foi possível observar a perda de trimetilamina (íon de m/z 749,6) e o ciclofosfano (íon de m/z 147,0). Finalmente, para o modo de íon negativo, foram isolados e fragmentados o íon de m/z 863,6 que foi atribuído como PI36:1, devido à presença de m/z 153 (fosfato de glicerol – H2O-H ), 223 (inositol fosfo - 2H2O-H) , 241 (fosfoinositol – H2O-H), 281 (ácido oleico) e 581,3 (lisofosfoinositol – H2O+H). Concluímos que a MALDI - MS permite a detecção de uma ampla gama de espécies de PC, SM, PE, PI e TAG lipídicas, bem como a caracterização rápida e confiante de estruturas lipídicas a partir de um único embrião equino.The aim of this work was to report the potential of MALDI-MS for the characterization of lipid species present in a single equine embryo, and to study some lipid structures detected by collision induced dissociation (CID) experiments. In the positive ion mode spectrum, we could observe mostly protonated and sodiated species of sphingomyelins (SM), phosphatidylcholines (PC) and triacylglycerols (TAG). In the negative ion mode, we observed phosphatidylethanolamines (PE) and phosphatidylinositols (PI). MS/MS spectrum of most intense lipid ions was performed to show MALDI-MS/MS structural information potential. MS/MS spectrum in the positive mode of m/z 760.6 (attributed as PC34:1) depicted characteristic PC fragments of m/z 184.1 (choline polar head), and the neutral loss (NL) of 183 (phosphorylcholine). For the ion of m/z 766.6 (attributed as PE 38:5), we observed the NL of 140, characteristic of PE. For the ion of m/z 808.7 (attributed as PC 38.5), besides the fragment at m/z 184.1 at the NL of 183, it was possible to observe the loss of trimethylamine (ion of m/z 749.6), and the cyclophosphane (ion of m/z 147.0). Finally, for the negative ion mode, we isolated and fragmented the ion at m/z 863.6, which was attributed as PI 36:1 due to the presence of m/z 153 (glycerol phosphate – H2O-H), 223 (phospho inositol – 2H2O-H), 241 (phospho inositol – H2O-H), 281 (oleic acid), and 581.3 (lysophosphoinositol – H2O-H). We conclude that MALDI-MS allowed the detection of a broad range of PC, SM, PE, PI and TAG lipid species, as well as a fast and confident characterization of lipid structures from a single equine embryo.

Efeito da suplementação dietética com óleo de babaçu sobre o desempenho de éguas em lactação

A exigência nutricional das éguas é mais alta nos primeiros três meses de lactação. A energia é importante para que possam manter a condição corporal e produzir leite para os potros. Investigou-se o efeito da variação do peso corporal de éguas em lactação mantidas sob uma dieta suplementada por um concentrado com quatro níveis (0, 4, 8 e 16%) de óleo de babaçu. Foram utilizadas 16 éguas sem raça definida e em lactação e com peso vivo médio de 441,2 kg. O concentrado usado na suplementação dos animais foi de 1,5% do peso vivo, sendo composto de quirera de milho, farelo de soja e farelo de trigo com 16% de proteína bruta. A água e o volumoso constituído de Napier e suplemento mineral foram fornecidos ad libitum. As éguas foram colocadas em baias individuais (4 x 5 m) onde receberam as 4 dietas, uma vez ao dia. As dietas foram oferecidas durante 42 dias. Ao término do experimento observou-se que a suplementação com óleo de babaçu não afetou condição corporal das éguas. Os resultados indicaram que, em condições tropicais, pode-se suplementar a alimentação com até 4% de óleo de babaçu.Mares have the highest nutrient requirement in the first three months of lactation. Energy is important for mares to maintain body condition and produce milk for their foals. The effect on body weight changes were investigated through supplemental coconut oil (CO) at four levels (0, 4, 8 and 16%) in concentrate fed to 16 multiparous mares in early lactation with average body weight 441.2 Kg. Mares were fed 1,5% live weight with concentrate composed of corn meal, wheat bran and soybean meal with 16% crude protein. The forage was Napier grass, mineral supplement and water "ad libitum". Mares were allotted to 16 pens (4x5m) and randomly assigned to receive four diets once a day during 42 days. At the end of the experiment the CO supplementation did not affect mares body condition The results indicated that in tropical conditions level at 4% CO supplementation had better results for lactating mares

Comparison of different methods for exogenous DNA uptake by bovine spermatozoa

Apesar da manipulação genética de animais domésticos ser de grande interesse para a produção animal e para a indústria farmacêutica, a sua eficiência ainda é insatisfatória. A injeção pronuclear, a técnica mais utilizada para tal proposito, principalmente em camundongos, ainda apresenta limitações para esta espécie. Algumas alternativas têm sido desenvolvidas como o uso de espermatozoides como vetores para transferência genica, na qual a célula espermática tem habilidade espontânea de se ligar a molécula de DNA e internaliza-la. Dado o potencial da transferência genica mediada por espermatozoide para animais domésticos transgênicos, o objetivo do presente trabalho foi a avaliação de quatro métodos de incorporação de DNA para a transferência genica mediada por espermatozoides na espécie bovina: incubação com DNA, alteração da membrana plasmática induzida por cálcio ionóforo seguida por incubação com o DNA exógeno, eletroporação e lipofecção. Espermatozoides não expostos ao DNA exógeno foram usados como grupo controle. Os índices de clivagem, blastocisto e eclosão foram avaliados, respectivamente, as 72 horas após a inseminação dos oócitos, bem como, aos 9 e 12 dias de cultivo embrionário. Os embriões positivos para o DNA exógeno foram avaliados por PCR. Nenhum efeito de tratamento foi observado nos índices de clivagem, blastocisto e eclosão. Além disso, a porcentagem de blastocistos positivos para o DNA exógeno não diferiu entre os grupos experimentais. Apesar do baixo número de embriões positivos para DNA exógeno, os resultados obtidos mostram que todos os tratamentos apresentaram eficiências similares. A conclusão obtida foi que, apesar de os índices de desenvolvimento embrionário terem sido similares e constante em todos os grupos experimentais, outros fatores como a sequência, o tamanho e a concentração do DNA exógeno devem ser avaliados para melhorar a transferência genica mediada por espermatozoides.Although genetic manipulation of farm animals is of great interest for animal production and the pharmaceutical industry, its efficiency remains far from satisfactory. Pronuclear injection, which is the most widely used technique for such modification, mainly in mice, remains limited for this species. Some alternatives have been developed such as sperm mediated gene transfer, in which the spermatozoa are used as vectors for DNA delivery during in vitro fertilization. Mature sperm cells are able to spontaneously bind exogenous DNA molecules which may be internalized into sperm nuclei. Given the potential of sperm mediated gene transfer for livestock animals transgenesis, the aim of this study was to evaluate four methods of DNA uptake for sperm mediated gene transfer in bovine: incubation with DNA, plasma membrane alteration induced by calcium ionophore followed by incubation with DNA, electroporation and lipofection. Spermatozoa not exposed to exogenous DNA were used as control group. Cleavage, blastocyst and hatching rates were recorded at 72 hours post insemination (hpi), days 9 and 12 of embryo culture, respectively. Exogenous DNA-positive embryos were evaluated by PCR. No effect of treatment was observed on cleavage, blastocyst and hatching rates. In addition, percentage of DNA positive blastocysts did not differ among experimental groups. In spite of the low number of positive embryos, our results show that all treatments presented similar efficiencies for DNA delivery during in vitro fertilization. In conclusion, although the development rates were similar and constant in all groups, other factors such as exogenous DNA sequence, size and concentration should be considered to improve sperm mediated gene transfer