Caracterización molecular del receptor de la Vitelogenia en Bactericera cockerelli [Sulc, 1909] (hemiptera:triozidae)

El permanente del tomate, la enfermedad de la punta morada, y el “Zebra chip” sonenfermedades que ocasionan daños considerables en los cultivos de tomate y papa,respectivamente. El agente causal es trasmitido por injerto o por interacción con plagas de insectos de la especie Bactericera cockerelli Sulc. En México en años recientes, B.cockerelli es considerada como plaga primaria, y es común que se realicen aplicaciones de insecticidas durante la etapa de cultivo. Se ha manifestado alarma debido a que hayfallas en el control por medios químicos, aunque puede atribuirse el problema a deficiente calibración de equipos de aplicación, baja cobertura de la aspersión en el follaje o la expresión fenotípica de la resistencia a insecticidas. Esto último, hace evidente la necesidad del desarrollo de métodos de control alternativos para este tipo de plaga. Recientemente, la genética es utilizada para obtener el máximo beneficio de ella y obtener blancos específicos de regulación en muy poco tiempo, aunado a esto, la relación que existe entre la reproducción y el proceso de vitelogénesis hace de esto una alternativa potencial para el control de insectos. Así, acoplando ambos conocimientos se podría aplicar una estrategia genética adecuada a largo plazo para alterar la expresión de los transcritos codificantes en el proceso de vitelogénesis reduciendo de esta forma la población plaga y la propagación de las enfermedades. El objetivo de este trabajo estuvo encaminado a caracterizar parcialmente y cuantificar el receptor de vitelogenina en B. cockerelli. Para llevar a cabo este estudio, se cubrió los siguientes objetivos particulares; se buscó la secuencia del receptor de vitelogenina por dos estrategias, con secuencias publicadas de otras especies de insectos y por el transcriptoma de B. cockerelli. La caracterización parcial del receptor se hizo a través de las secuencias nucleotídicas obtenidas por PCR en punto final, y secuenciación por electroforesis capilar. La cuantificación relativa se realizó por la técnica de PCR en tiempo real para reportar los niveles de expresión del receptor en adultos y ninfas. El porcentaje de similitud de la secuencia de vitelogenina obtenida en el laboratorio en comparación con la secuencia del transcriptoma completo de la especie reportada en el GenBank fue de un 90%. Los análisis de expresión demostraron que el receptor de vitelogenina se encuentra expresado tanto en hembras como en machos de B. cockerelli, recolectados directamente del cultivo de papa, siendo significativamente mayor en las hembras. Al analizar la expresión relativa en ninfas provenientes de confinamiento en invernadero se encontró una menor expresión del receptor en comparación con los especímenes de campo. Estudios futuros sobre el receptor de la vitelogenina son necesarios para dilucidar la secuencia completa del mismo y considerarla como un blanco potencial para el control de esta especie plaga

Efecto del motivo WRPW en la actividad funcional de antennapedia en Drosophila melanogaster

Los genes homeóticos permiten el control genético del desarrollo de los diferentes organismos en la especificación del plan corporal. Estos genes presentan dos secuencias altamente conservadas: el homeobox que codifica a un péptido de 60 aminoácidos conocido como homeodominio (HD) que es el sitio de unión al DNA y el tetrapéptidoYPWM que se ha involucrado en interacciones proteína-proteína. Estos dominios estan presentes en la homeoproteína Antennapedia (Antp) que es un factor transcripcional que controla la formación de los segmentos torácicos en Drosophila melanogaster. Similarmente, la proteína Hairy contiene el motivo WRPW que es capaz de conferir actividad represora debido al reclutamiento del corepresor Groucho. Debido a que la actividad funcional de las diferentes proteínas homeóticas esta dada por un balance regulado por los mecanismos de activación/represión de las homeoproteínas para la regulación de los genes blanco, en esta tesis se realizó la adición del motivo de represión transcripcional WRPW, en el extremo C-terminal de Antp para determinar el efecto de un motivo de represión adicional en la actividad funcional de Antp durante el desarrollo embrionario y en la actividad de un gen blanco en D. melanogaster. Para cumplir con los objetivos se llevó a cabo la clonación de las secuencias nucleotídicas codificantes a Antp y sus mutantes con la fusión a WRPW en el vector pUAST. Los vectores recombinantes fueron microinyectados en embriones de moscas w1118 para la obtención de las líneas transgénicas, en las que se analizó la expresión ectópica de Antp quimérica usando el sistema binario GAL4-UAS mediante cruzas con la línea Hs-GAL4. Las larvas producto de las cruzas fueron analizadas para la determinación de los efectos fenotípicos producidos por la inserción AntpWRPW. El análisis de activación transcripcional del gen blanco tsh se realizó mediante cruzas genéticas con la línea patched-GAL4 para detectar el efecto del motivo WRPW en la actividad funcional de Antp. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran evidentemente que la adición del motivo WRPW en el extremo C-terminal de Antp incrementó la actividad funcional de esta homeoproteína en la transformación homeótica T1 a T2 y en la activación del gen blanco tsh. Adicionalmente, la presencia de WRPW en Antp con ausencia del tetrapéptido YPWM rescató el fenotipo de esta mutante sugiriendo la actividad similar de YPWM y WRPW como motivos de represión transcripcional. Sorprendentemente, el tetrapéptido YPWM de Antp mostró ser indispensable para la activación del gen blanco tsh en la región de la cabeza de los embriones de D. melanogaster debido a que la presencia de WRPW no afectó la activación de tsh. La importancia del análisis de las funciones activadoras ó represoras de las homeoproteínas es fundamental para entender el mecanismo por el cual éstas regulan los genes blanco. Los ensayos que se realizaron en esta tesis podrían complementarse al estudiar más genes blanco, como es el caso de fkh[250con ] ó apterous, que son regulados por Antp. Además, deberá analizarse en ensayos de interacción si realmente el correpresor Groucho esta siendo reclutando por la proteína mutante YPWMAntpWRPW, así como también el cofactor TAFII155 que podría ser la proteína que interacciona en la actividad de la homeoproteína Antp a través del tetrapéptido YPWM

Current Status of the Insecticide Resistance in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) from Mexico

The mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) is the primary vector of dengue in Mexico and lately virus Chikungunya, although Aedes albopictus is widely distributed; its role in both diseases’ transmission has not been confirmed. The control of mosquitoes in Mexico includes source reduction consisting in the elimination of containers that are favorable sites for oviposition and development of the aquatic stage. The use of insecticides is to control larvae and adulticides as outdoor ultra-low volume applications and indoor residual spray and more recently impregnated materials. The health department regulates the use of insecticides, and such regulations are revised and adapted over time. Since 1999, the vector control regulations gave preference to the use of pyrethroids, a permethrin-based formulation to control adult forms. This insecticide was used as the only adulticide in Mexico for more than 10 years. The consequences of this actions have evolved in a widespread and strong resistance to other insecticides, mainly pyrethroids. We include in this revision evidence of resistance reported in Ae. aegypti in Mexico

Profiles of Amino Acids and Acylcarnitines Related with Insecticide Exposure in Culex quinquefasciatus (Say).

Culex quinquefasciatus Say is a vector of many pathogens of humans, and both domestic and wild animals. Personal protection, reduction of larval habitats, and chemical control are the best ways to reduce mosquito bites and, therefore, the transmission of mosquito-borne pathogens. Currently, to reduce the risk of transmission, the pyrethroids, and other insecticide groups have been extensively used to control both larvae and adult mosquitoes. In this context, amino acids and acylcarnitines have never been associated with insecticide exposure and or insecticide resistance. It has been suggested that changes in acylcarnitines and amino acids profiles could be a powerful diagnostic tool for metabolic alterations. Monitoring these changes could help to better understand the mechanisms involved in insecticide resistance, complementing the strategies for managing this phenomenon in the integrated resistance management. The purpose of the study was to determine the amino acids and acylcarnitines profiles in larvae of Cx. quinquefasciatus after the exposure to different insecticides. Bioassays were performed on Cx. quinquefasciatus larvae exposed to the diagnostic doses (DD) of the insecticides chlorpyrifos (0.001 μg/mL), temephos (0.002 μg/mL) and permethrin (0.01 μg/mL). In each sample, we analyzed the profile of 12 amino acids and 31 acylcarnitines by LC-MS/MS. A t-test was used to determine statistically significant differences between groups and corrections of q-values. Results indicates three changes, the amino acids arginine (ARG), free carnitine (C0) and acetyl-carnitine (C2) that could be involved in energy production and insecticide detoxification. We confirmed that concentrations of amino acids and acylcarnitines in Cx. quinquefasciatus vary with respect to different insecticides. The information generated contributes to understand the possible mechanisms and metabolic changes occurring during insecticide exposure

Differences in <i>Cx</i>. <i>quinquefasciatus</i> larvae exposed to different insecticides relative to unexposed.

<p>Differences in <i>Cx</i>. <i>quinquefasciatus</i> larvae exposed to different insecticides relative to unexposed.</p

Mean and observed measurements of identified metabolites.

<p>Arg, C0, and C2 from left to right. Each dot corresponds to a sample. Crossed circle represent the mean for each treatment group. The vertical axis shows the measurements. The horizontal axis represents samples and treatment groups.</p