13 research outputs found
Biologische Charakterisierung von Indolochinolizinen
Laut einer SchĂ€tzung werden im Jahr 2020, durch Faktoren wie die Ăberalterung der
Weltbevölkerung, die Verwestlichung der ErnÀhrungsgewohnheiten und die zunehmende
Umweltverschmutzung, 15 Millionen neue KrebsfÀlle diagnostiziert und 12 Millionen Menschen
werden auf Grund einer Krebserkrankung sterben (Bray & Moller, 2006). Dies verdeutlicht die
Wichtigkeit, neue Wirkstoffe zu entwickeln, die in der Lage sind Krebserkrankungen aufzuhalten
oder besser noch zu heilen. Ein beliebter Ansatzpunkt fĂŒr Therapeutika ist der Zellzyklus, um die
Hyperproliferation von Tumorzellen zu stoppen und die Zellen nachfolgend in die Apoptose zu
leiten. Viele in der Klinik erfolgreich eingesetzte Chemotherapeutika verÀndern die Tubulin-
Dynamik und inhibieren somit den mitotischen Spindelapparat, was zu einer Arretierung der
Mitose und dem anschlieĂenden Absterben der Tumorzellen fĂŒhrt. Aufgrund der Tatsache, dass
dynamische Mikrotubuli auch wichtige Funktionen in nicht proliferierenden Zellen erfĂŒllen, fĂŒhrt
der Einsatz von Tubulin-bindenden Wirkstoffen zu zahlreichen Nebenwirkungen. Deshalb ist es
von groĂer Bedeutung niedermolekulare Substanzen zu identifizieren, welche geeignet sind,
andere wesentliche Proteine des Zellzyklus zu modifizieren und dadurch den Tod der
Tumorzellen herbeizufĂŒhren.
Bereits im Vorfeld wurden in einem zellulÀren Testsystem Substanzen aus einer
abteilungseigenen Indolochinolizin-Bibliothek identifiziert, welche in der Lage waren den
Zellzyklus zu inhibieren. Der durch diese Substanzen induzierte PhÀnotyp konnte durch die im
Rahmen dieser Arbeit durchgefĂŒhrten Analysen, wie Lebendzell-Mikroskopie, Immunfluoreszenz
und Durchflusszytometrie, nĂ€her beschrieben werden. So fĂŒhrte die Inkubation von HeLa-Zellen
mit den Indolochinolizinen zu fehlorientierten Chromosomen wÀhrend der Metaphase und dem
Auftreten von zusĂ€tzlichen Spindelpolen, was zu multipolaren Spindeln fĂŒhrte. Dieser PhĂ€notyp
lieĂ vermuten, dass die Zellen nicht mehr in der Lage sind ihre Centrosomen zu âzĂ€hlenâ,
weshalb die aktiven Substanzen als Centrocountine bezeichnet wurden. AuĂerdem konnten
Immunfluoreszenz-Aufnahmen einer BUB1-FĂ€rbung eine Aktivierung des Spindel-
Kontrollpunktes zeigen. Die Analyse des Interkinetochor-Abstandes wies darauf hin, dass die
Aktvierung des Kontrollpunktes durch eine fehlende Spannung zwischen den Kinetochoren und
den Mikrotubuli ausgelöst wurde. Die Spindel-Kontrollpunkt-Aktivierung resultierte in einem
mitotischen Arrest, welcher durch die etwa fĂŒnfmal so lange Mitose-Dauer von mit
Centrocountin 1 behandelten Zellen im Gegensatz zu den Kontrollzellen gezeigt werden konnte.
Auch die Zellzyklus-Analyse zeigte einen konzentrationsabhÀngigen Anstieg der mitotischen
Zellen. Ferner war ein RĂŒckgang der HeLa-Zellproliferation auf etwa 60% zu verzeichnen. Dieser
war zum einen durch das Anhalten des Zellzyklus in der M-Phase, zum anderen durch das
Einsetzen der Apoptose zu erklÀren. Durch Immunfluoreszenz-Aufnahmen in acht weiteren
Zelllinien konnte gezeigt werden, dass das Auftreten der fehlorientierten Chromosomen sowie
der zusĂ€tzlichen Spindelpole zelltypĂŒbergreifend ist.
Aufgrund des interessanten PhÀnotyps war es im weiteren Verlauf von besonderer Bedeutung
die Zielproteine der Centrocountine zu identifzieren. So wurde zunÀchst versucht eine
Zielprotein-Identifizierung mittels wissenschaftlicher Hypothesen durchzufĂŒhren. Zu den
potentiellen Zielproteinen zÀhlten Tubulin, zahlreiche Zellzyklus-spezifische Kinasen und die
Phosphatase CDC25a, welche jedoch alle mit Hilfe entsprechender in vitro oder in vivo
Testsysteme ausgeschlossen werden konnten. Basierend auf den oben beschriebenen
phÀnotypischen Analysen konnte eine Struktur-AktivitÀts-Beziehung aufgestellt werden, welche
die Synthese einer Sonde fĂŒr die AffinitĂ€tschromatographie ermöglichte. Die hergestellte Sonde
wurde ĂŒber ein freies Amin an eine NHS-aktivierte Sepharose gekoppelt, so dass eine
AffinitĂ€tsreinigung mit HeLa-Zelllysaten durchgefĂŒhrt werden konnte. Mit Hilfe einer
Kombination aus der vergleichenden und kompetitiven Variante der AffinitÀtschromatographie
konnte das nukleolare Protein Nucleophosmin (NPM) als Zielprotein identifiziert werden. Die
anschlieĂende Literaturrecherche ergab, dass das Ausschalten von NPM durch RNAi Ă€hnliche
Effekte, wie die durch Centrocountin ausgelösten, verursachte. Auch eine Störung der Bindung
des nuklearen Export-Rezeptors CRM1 an NPM fĂŒhrte zu dem beobachteten PhĂ€notyp. So
wurden fĂŒr folgende Validierungs-Experimente sowohl NPM als auch der NPM-CRM1-Komplex
als mögliche Bindungspartner in Betracht gezogen. Sowohl NPM als auch CRM1 konnten mittels
Immundetektion nach erfolgter AffinitÀtschromatographie nachgewiesen werden. Ebenso war
eine konzentrationsabhĂ€ngige VerdrĂ€ngung mit einem Ăberschuss an Centrocountin 1 zu
verzeichnen. Ferner konnte durch Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie und Fluoreszenz-
Polarisation in vivo und in vitro eine Bindung beider Proteine an ein mit Cy3 modifiziertes
Centrocountin gezeigt werden. Aufgrund der diversen Aufgaben von NPM in der Zelle könnten
neben der NPM-CRM1 Interaktion, auch weitere Protein-Protein-Interaktionen gestört werden,
welche die beschriebenen PhĂ€notypverĂ€nderungen hervorrufen wĂŒrden. Dementsprechend
könnten eine gehinderte Interaktion von NPM und PCNA wÀhrend der DNA-Reparatur, von NPM
und p14ARF sowie von NPM und RB zu einer Aktivierung von p53 und dem nachgeschaltetem
p21WAF1/CIP1 fĂŒhren. Dies wĂŒrde einen Zellzyklus-Arrest auslösen, welcher oftmals in Verbindung
mit der Apoptose steht. Einen Hinweis auf diesen möglichen Wirkmechanismus gaben die
erhöhten Protein-Niveaus von p53 und p21WAF1/CIP1, welche in mit Centrocountin behandelten
MCF7- und HCT-116-Zellen nachgewiesen werden konnten. Gehemmte Interaktionen zwischen
NPM und ROCK2, NPM und BRCA2 und natĂŒrlich NPM und CRM1 könnten auĂerdem zu einer
Centrosomen-Fragmentierung bzw. Ăberduplikation fĂŒhren, welches ebenfalls ein Anhalten des
Zellzyklus oder die Aptoptose zur Folge hÀtte. Aufgrund der Tatsache, dass NPM proto-onkogene
Funktionen ausĂŒbt und das am hĂ€ufigsten mutierte Gen in hĂ€matopoetischen Tumoren ist, ist
die Entdeckung von Centrocountin, einem neuen NPM-Inhibitor, von besonderer Bedeutung.
Auch Centrocountin als biologisches Werkzeug nutzen zu können, um die zahlreichen zellulÀren
Funktionen von NPM besser zu untersuchen und zu verstehen, kann nicht auĂer Acht gelassen
werden
PD-L1 is expressed on human platelets and is affected by immune checkpoint therapy
Cancer immunotherapy has been revolutionised by drugs that enhance the ability of the immune system to detect and fight tumors. Immune checkpoint therapies that target the programmed death-1 receptor (PD-1), or its ligand (PD-L1) have shown unprecedented rates of durable clinical responses in patients with various cancer types. However, there is still a large fraction of patients that do not respond to checkpoint inhibitors, and the challenge remains to find cellular and molecular cues that could predict which patients would benefit from these therapies. Using a series of qualitative and quantitative methods we show here that PBMCs and platelets from smokers and patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) or lung cancer express and up-regulate PD-L1 independently of tumor stage. Furthermore, treatment with Atezolizumab, a fully humanised monoclonal antibody against PD-L1, in 4 patients with lung cancer caused a decrease in PD-L1 expression in platelets, which was restored over 20 days. Altogether, our findings reveal the expression of the main therapeutic target in current checkpoint therapies in human platelets and highlight their potential as biomarkers to predict successful therapeutic outcomes
PD-L1 is expressed on human platelets and is affected by immune checkpoint therapy
Cancer immunotherapy has been revolutionised by drugs that enhance the ability of the immune system to detect and fight tumors. Immune checkpoint therapies that target the programmed death-1 receptor (PD-1), or its ligand (PD-L1) have shown unprecedented rates of durable clinical responses in patients with various cancer types. However, there is still a large fraction of patients that do not respond to checkpoint inhibitors, and the challenge remains to find cellular and molecular cues that could predict which patients would benefit from these therapies. Using a series of qualitative and quantitative methods we show here that PBMCs and platelets from smokers and patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) or lung cancer express and up-regulate PD-L1 independently of tumor stage. Furthermore, treatment with Atezolizumab, a fully humanised monoclonal antibody against PD-L1, in 4 patients with lung cancer caused a decrease in PD-L1 expression in platelets, which was restored over 20 days. Altogether, our findings reveal the expression of the main therapeutic target in current checkpoint therapies in human platelets and highlight their potential as biomarkers to predict successful therapeutic outcomes
Nanomechanics and Sodium Permeability of Endothelial Surface Layer Modulated by Hawthorn Extract WS 1442
The endothelial glycocalyx (eGC) plays a pivotal role in the physiology of the vasculature. By binding plasma proteins, the eGC forms the endothelial surface layer (ESL) which acts as an interface between bloodstream and endothelial cell surface. The functions of the eGC include mechanosensing of blood flow induced shear stress and thus flow dependent vasodilation. There are indications that levels of plasma sodium concentrations in the upper range of normal and beyond impair flow dependent regulation of blood pressure and may therefore increase the risk for hypertension. Substances, therefore, that prevent sodium induced endothelial dysfunction may be attractive for the treatment of cardiovascular disease. By means of combined atomic force - epifluorescence microscopy we studied the impact of the hawthorn (Crataegus spp.) extract WS 1442, a herbal therapeutic with unknown mechanism of action, on the mechanics of the ESL of ex vivo murine aortae. Furthermore, we measured the impact of WS 1442 on the sodium permeability of endothelial EA.hy 926 cell monolayer. The data show that (i) the ESL contributes by about 11% to the total endothelial barrier resistance for sodium and (ii) WS 1442 strengthens the ESL resistance for sodium up to about 45%. This mechanism may explain some of the vasoprotective actions of this herbal therapeutic
Zwischen Vermarktlichung und EuropÀisierung: Die wachsende Bedeutung transnational agierender Vermittlungsagenturen in der hÀuslichen Pflege in Deutschland
Der Beitrag befasst sich mit jĂŒngeren Entwicklungen im Bereich der transnationalen Care-Migration und analysiert in diesem Feld das Zusammenwirken von Prozessen der Vermarktlichung und EuropĂ€isierung. Aufgrund von Regulierungs- und KontrolllĂŒcken im EU-Mehrebenensystem, so das hier prĂ€sentierte Argument, ist ein boomendes GeschĂ€ftsfeld fĂŒr neue Akteure entstanden: Vermittlungs- und Entsendeagenturen fĂŒr Live-In-PflegekrĂ€fte aus Mittel- und Osteuropa. Der Beitrag geht in einem ersten Schritt der Frage nach, wie diese Regulierungs- und Kontrolldefizite eines europĂ€isierten Pflegemarktes von den Agenturen und ihren politischen VerbĂ€nden (aus-)genutzt und gefĂŒllt werden. In einem zweiten Schritt werden die Implikationen von Vermarktlichung und EuropĂ€isierung auf der Ebene der Nutzer*innen analysiert. PrĂ€sentiert werden Ergebnisse aus einer qualitativen Studie mit Familien PflegebedĂŒrftiger, die Kund*innen der Vermittlungsagenturen sind.
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Between Marketization and Europeanization: The Growing Importance of Transnationally Acting Agencies for Domestic Care Work in Germany
This article looks at recent developments in the field of transnational care migration, analysing the interacting processes of marketisation and Europeanisation. We argue that as a result of regulation and control gaps within the EU multilevel system, a burgeoning business sector has emerged, facilitating the establishment of new actors: posting and brokering agencies for live-in care workers from Central and Eastern Europe. First, we address the question of how these regulation and control gaps within a Europeanised care market are being (mis)used by agencies and their political associations. Second, we analyse the implications of marketisation and Europeanisation on the level of the users (households). The analysis is based on results from a qualitative study with families employing an agency brokered transnational care worker.
JEL-Klassifizierung: I13
Advantages and challenges of phenotypic screens: The identification of two novel antifungal geranylgeranyltransferase I inhibitors
Phenotypic screens are still the most effective starting points for compounds with desirable activities. To identify novel antifungal leads we have conducted a phenotypic screen in the yeast Saccharomyces cerevisiae and identified two different scaffolds with good growth inhibitory characteristics. Lack of broad spectrum antifungal activity against pathogenic fungi raised the question about the modulated target as required for directed chemical compound optimization. Chemogenomic profiling identified effects on geranylgeranyltransferase I (GGTase I), an enzyme that prenylates proteins involved in cell signaling like Cdc42p and Rho1p. Raising resistant mutants against both compounds confirmed the target hypothesis and allowed mapping of the compound binding site to the substrate binding pocket. Differential resistance conferring mutations and substrate competition for only one chemotype demonstrated a diverse binding mode for the two chemotypes. Exchange of the S.cerevisiae GGTase I complex by that of Candida albicans abolished growth inhibitory activity of both compounds thus confirming the identified target as well as the observed narrow antifungal spectrum. Reported lack of essentiality of this prenylation pathway in pathogenic species challenges the therapeutic value of these leads and demonstrates the importance of an integrated target identification platform following a phenotypic screen
Direct Interaction of Chivosazole F with Actin Elicits Cell Responses Similar to Latrunculin A but Distinct from Chondramide
The
microbial metabolite Chivosazole F has been described to affect
the cytoskeleton and to inhibit actin polymerization <i>in vitro</i>. Applying orthogonal genomic and proteomics approaches, we now show
for the first time that Chivosazole F exerts its effect by directly
interacting with actin and demonstrate the cellular impact of Chivosazole
F in an unbiased, genome-wide context in yeast and in mammalian cells.
Furthermore, mutation-based resistance mapping identifies two SNPs
located in the putative Chivosazole F binding site of actin. Comparing
chemogenomic profiles and responses to the Chivosazole F-resistant
SNPs shows a partially conserved mechanism of action for Chivosazole
F and Latrunculin A, but clear divergence from Chondramide. In addition,
C14orf80 is an evolutionarily highly conserved ORF, lacking any functional
annotation. As editing of C14orf80 leads to Chivosazole F hyper-resistance,
we propose a function for this gene product in counteracting perturbation
of actin filaments
Direct Interaction of Chivosazole F with Actin Elicits Cell Responses Similar to Latrunculin A but Distinct from Chondramide
The
microbial metabolite Chivosazole F has been described to affect
the cytoskeleton and to inhibit actin polymerization <i>in vitro</i>. Applying orthogonal genomic and proteomics approaches, we now show
for the first time that Chivosazole F exerts its effect by directly
interacting with actin and demonstrate the cellular impact of Chivosazole
F in an unbiased, genome-wide context in yeast and in mammalian cells.
Furthermore, mutation-based resistance mapping identifies two SNPs
located in the putative Chivosazole F binding site of actin. Comparing
chemogenomic profiles and responses to the Chivosazole F-resistant
SNPs shows a partially conserved mechanism of action for Chivosazole
F and Latrunculin A, but clear divergence from Chondramide. In addition,
C14orf80 is an evolutionarily highly conserved ORF, lacking any functional
annotation. As editing of C14orf80 leads to Chivosazole F hyper-resistance,
we propose a function for this gene product in counteracting perturbation
of actin filaments
Direct Interaction of Chivosazole F with Actin Elicits Cell Responses Similar to Latrunculin A but Distinct from Chondramide
The
microbial metabolite Chivosazole F has been described to affect
the cytoskeleton and to inhibit actin polymerization <i>in vitro</i>. Applying orthogonal genomic and proteomics approaches, we now show
for the first time that Chivosazole F exerts its effect by directly
interacting with actin and demonstrate the cellular impact of Chivosazole
F in an unbiased, genome-wide context in yeast and in mammalian cells.
Furthermore, mutation-based resistance mapping identifies two SNPs
located in the putative Chivosazole F binding site of actin. Comparing
chemogenomic profiles and responses to the Chivosazole F-resistant
SNPs shows a partially conserved mechanism of action for Chivosazole
F and Latrunculin A, but clear divergence from Chondramide. In addition,
C14orf80 is an evolutionarily highly conserved ORF, lacking any functional
annotation. As editing of C14orf80 leads to Chivosazole F hyper-resistance,
we propose a function for this gene product in counteracting perturbation
of actin filaments
Direct Interaction of Chivosazole F with Actin Elicits Cell Responses Similar to Latrunculin A but Distinct from Chondramide
The
microbial metabolite Chivosazole F has been described to affect
the cytoskeleton and to inhibit actin polymerization <i>in vitro</i>. Applying orthogonal genomic and proteomics approaches, we now show
for the first time that Chivosazole F exerts its effect by directly
interacting with actin and demonstrate the cellular impact of Chivosazole
F in an unbiased, genome-wide context in yeast and in mammalian cells.
Furthermore, mutation-based resistance mapping identifies two SNPs
located in the putative Chivosazole F binding site of actin. Comparing
chemogenomic profiles and responses to the Chivosazole F-resistant
SNPs shows a partially conserved mechanism of action for Chivosazole
F and Latrunculin A, but clear divergence from Chondramide. In addition,
C14orf80 is an evolutionarily highly conserved ORF, lacking any functional
annotation. As editing of C14orf80 leads to Chivosazole F hyper-resistance,
we propose a function for this gene product in counteracting perturbation
of actin filaments