Biologische Charakterisierung von Indolochinolizinen

Laut einer Schätzung werden im Jahr 2020, durch Faktoren wie die Überalterung der Weltbevölkerung, die Verwestlichung der Ernährungsgewohnheiten und die zunehmende Umweltverschmutzung, 15 Millionen neue Krebsfälle diagnostiziert und 12 Millionen Menschen werden auf Grund einer Krebserkrankung sterben (Bray & Moller, 2006). Dies verdeutlicht die Wichtigkeit, neue Wirkstoffe zu entwickeln, die in der Lage sind Krebserkrankungen aufzuhalten oder besser noch zu heilen. Ein beliebter Ansatzpunkt für Therapeutika ist der Zellzyklus, um die Hyperproliferation von Tumorzellen zu stoppen und die Zellen nachfolgend in die Apoptose zu leiten. Viele in der Klinik erfolgreich eingesetzte Chemotherapeutika verändern die Tubulin- Dynamik und inhibieren somit den mitotischen Spindelapparat, was zu einer Arretierung der Mitose und dem anschließenden Absterben der Tumorzellen führt. Aufgrund der Tatsache, dass dynamische Mikrotubuli auch wichtige Funktionen in nicht proliferierenden Zellen erfüllen, führt der Einsatz von Tubulin-bindenden Wirkstoffen zu zahlreichen Nebenwirkungen. Deshalb ist es von großer Bedeutung niedermolekulare Substanzen zu identifizieren, welche geeignet sind, andere wesentliche Proteine des Zellzyklus zu modifizieren und dadurch den Tod der Tumorzellen herbeizuführen. Bereits im Vorfeld wurden in einem zellulären Testsystem Substanzen aus einer abteilungseigenen Indolochinolizin-Bibliothek identifiziert, welche in der Lage waren den Zellzyklus zu inhibieren. Der durch diese Substanzen induzierte Phänotyp konnte durch die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen, wie Lebendzell-Mikroskopie, Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie, näher beschrieben werden. So führte die Inkubation von HeLa-Zellen mit den Indolochinolizinen zu fehlorientierten Chromosomen während der Metaphase und dem Auftreten von zusätzlichen Spindelpolen, was zu multipolaren Spindeln führte. Dieser Phänotyp ließ vermuten, dass die Zellen nicht mehr in der Lage sind ihre Centrosomen zu „zählen“, weshalb die aktiven Substanzen als Centrocountine bezeichnet wurden. Außerdem konnten Immunfluoreszenz-Aufnahmen einer BUB1-Färbung eine Aktivierung des Spindel- Kontrollpunktes zeigen. Die Analyse des Interkinetochor-Abstandes wies darauf hin, dass die Aktvierung des Kontrollpunktes durch eine fehlende Spannung zwischen den Kinetochoren und den Mikrotubuli ausgelöst wurde. Die Spindel-Kontrollpunkt-Aktivierung resultierte in einem mitotischen Arrest, welcher durch die etwa fünfmal so lange Mitose-Dauer von mit Centrocountin 1 behandelten Zellen im Gegensatz zu den Kontrollzellen gezeigt werden konnte. Auch die Zellzyklus-Analyse zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg der mitotischen Zellen. Ferner war ein Rückgang der HeLa-Zellproliferation auf etwa 60% zu verzeichnen. Dieser war zum einen durch das Anhalten des Zellzyklus in der M-Phase, zum anderen durch das Einsetzen der Apoptose zu erklären. Durch Immunfluoreszenz-Aufnahmen in acht weiteren Zelllinien konnte gezeigt werden, dass das Auftreten der fehlorientierten Chromosomen sowie der zusätzlichen Spindelpole zelltypübergreifend ist. Aufgrund des interessanten Phänotyps war es im weiteren Verlauf von besonderer Bedeutung die Zielproteine der Centrocountine zu identifzieren. So wurde zunächst versucht eine Zielprotein-Identifizierung mittels wissenschaftlicher Hypothesen durchzuführen. Zu den potentiellen Zielproteinen zählten Tubulin, zahlreiche Zellzyklus-spezifische Kinasen und die Phosphatase CDC25a, welche jedoch alle mit Hilfe entsprechender in vitro oder in vivo Testsysteme ausgeschlossen werden konnten. Basierend auf den oben beschriebenen phänotypischen Analysen konnte eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung aufgestellt werden, welche die Synthese einer Sonde für die Affinitätschromatographie ermöglichte. Die hergestellte Sonde wurde über ein freies Amin an eine NHS-aktivierte Sepharose gekoppelt, so dass eine Affinitätsreinigung mit HeLa-Zelllysaten durchgeführt werden konnte. Mit Hilfe einer Kombination aus der vergleichenden und kompetitiven Variante der Affinitätschromatographie konnte das nukleolare Protein Nucleophosmin (NPM) als Zielprotein identifiziert werden. Die anschließende Literaturrecherche ergab, dass das Ausschalten von NPM durch RNAi ähnliche Effekte, wie die durch Centrocountin ausgelösten, verursachte. Auch eine Störung der Bindung des nuklearen Export-Rezeptors CRM1 an NPM führte zu dem beobachteten Phänotyp. So wurden für folgende Validierungs-Experimente sowohl NPM als auch der NPM-CRM1-Komplex als mögliche Bindungspartner in Betracht gezogen. Sowohl NPM als auch CRM1 konnten mittels Immundetektion nach erfolgter Affinitätschromatographie nachgewiesen werden. Ebenso war eine konzentrationsabhängige Verdrängung mit einem Überschuss an Centrocountin 1 zu verzeichnen. Ferner konnte durch Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie und Fluoreszenz- Polarisation in vivo und in vitro eine Bindung beider Proteine an ein mit Cy3 modifiziertes Centrocountin gezeigt werden. Aufgrund der diversen Aufgaben von NPM in der Zelle könnten neben der NPM-CRM1 Interaktion, auch weitere Protein-Protein-Interaktionen gestört werden, welche die beschriebenen Phänotypveränderungen hervorrufen würden. Dementsprechend könnten eine gehinderte Interaktion von NPM und PCNA während der DNA-Reparatur, von NPM und p14ARF sowie von NPM und RB zu einer Aktivierung von p53 und dem nachgeschaltetem p21WAF1/CIP1 führen. Dies würde einen Zellzyklus-Arrest auslösen, welcher oftmals in Verbindung mit der Apoptose steht. Einen Hinweis auf diesen möglichen Wirkmechanismus gaben die erhöhten Protein-Niveaus von p53 und p21WAF1/CIP1, welche in mit Centrocountin behandelten MCF7- und HCT-116-Zellen nachgewiesen werden konnten. Gehemmte Interaktionen zwischen NPM und ROCK2, NPM und BRCA2 und natürlich NPM und CRM1 könnten außerdem zu einer Centrosomen-Fragmentierung bzw. Überduplikation führen, welches ebenfalls ein Anhalten des Zellzyklus oder die Aptoptose zur Folge hätte. Aufgrund der Tatsache, dass NPM proto-onkogene Funktionen ausübt und das am häufigsten mutierte Gen in hämatopoetischen Tumoren ist, ist die Entdeckung von Centrocountin, einem neuen NPM-Inhibitor, von besonderer Bedeutung. Auch Centrocountin als biologisches Werkzeug nutzen zu können, um die zahlreichen zellulären Funktionen von NPM besser zu untersuchen und zu verstehen, kann nicht außer Acht gelassen werden

PD-L1 is expressed on human platelets and is affected by immune checkpoint therapy

Cancer immunotherapy has been revolutionised by drugs that enhance the ability of the immune system to detect and fight tumors. Immune checkpoint therapies that target the programmed death-1 receptor (PD-1), or its ligand (PD-L1) have shown unprecedented rates of durable clinical responses in patients with various cancer types. However, there is still a large fraction of patients that do not respond to checkpoint inhibitors, and the challenge remains to find cellular and molecular cues that could predict which patients would benefit from these therapies. Using a series of qualitative and quantitative methods we show here that PBMCs and platelets from smokers and patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) or lung cancer express and up-regulate PD-L1 independently of tumor stage. Furthermore, treatment with Atezolizumab, a fully humanised monoclonal antibody against PD-L1, in 4 patients with lung cancer caused a decrease in PD-L1 expression in platelets, which was restored over 20 days. Altogether, our findings reveal the expression of the main therapeutic target in current checkpoint therapies in human platelets and highlight their potential as biomarkers to predict successful therapeutic outcomes

PD-L1 is expressed on human platelets and is affected by immune checkpoint therapy

Cancer immunotherapy has been revolutionised by drugs that enhance the ability of the immune system to detect and fight tumors. Immune checkpoint therapies that target the programmed death-1 receptor (PD-1), or its ligand (PD-L1) have shown unprecedented rates of durable clinical responses in patients with various cancer types. However, there is still a large fraction of patients that do not respond to checkpoint inhibitors, and the challenge remains to find cellular and molecular cues that could predict which patients would benefit from these therapies. Using a series of qualitative and quantitative methods we show here that PBMCs and platelets from smokers and patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) or lung cancer express and up-regulate PD-L1 independently of tumor stage. Furthermore, treatment with Atezolizumab, a fully humanised monoclonal antibody against PD-L1, in 4 patients with lung cancer caused a decrease in PD-L1 expression in platelets, which was restored over 20 days. Altogether, our findings reveal the expression of the main therapeutic target in current checkpoint therapies in human platelets and highlight their potential as biomarkers to predict successful therapeutic outcomes

Nanomechanics and Sodium Permeability of Endothelial Surface Layer Modulated by Hawthorn Extract WS 1442

The endothelial glycocalyx (eGC) plays a pivotal role in the physiology of the vasculature. By binding plasma proteins, the eGC forms the endothelial surface layer (ESL) which acts as an interface between bloodstream and endothelial cell surface. The functions of the eGC include mechanosensing of blood flow induced shear stress and thus flow dependent vasodilation. There are indications that levels of plasma sodium concentrations in the upper range of normal and beyond impair flow dependent regulation of blood pressure and may therefore increase the risk for hypertension. Substances, therefore, that prevent sodium induced endothelial dysfunction may be attractive for the treatment of cardiovascular disease. By means of combined atomic force - epifluorescence microscopy we studied the impact of the hawthorn (Crataegus spp.) extract WS 1442, a herbal therapeutic with unknown mechanism of action, on the mechanics of the ESL of ex vivo murine aortae. Furthermore, we measured the impact of WS 1442 on the sodium permeability of endothelial EA.hy 926 cell monolayer. The data show that (i) the ESL contributes by about 11% to the total endothelial barrier resistance for sodium and (ii) WS 1442 strengthens the ESL resistance for sodium up to about 45%. This mechanism may explain some of the vasoprotective actions of this herbal therapeutic

Zwischen Vermarktlichung und Europäisierung: Die wachsende Bedeutung transnational agierender Vermittlungsagenturen in der häuslichen Pflege in Deutschland

Der Beitrag befasst sich mit jüngeren Entwicklungen im Bereich der transnationalen Care-Migration und analysiert in diesem Feld das Zusammenwirken von Prozessen der Vermarktlichung und Europäisierung. Aufgrund von Regulierungs- und Kontrolllücken im EU-Mehrebenensystem, so das hier präsentierte Argument, ist ein boomendes Geschäftsfeld für neue Akteure entstanden: Vermittlungs- und Entsendeagenturen für Live-In-Pflegekräfte aus Mittel- und Osteuropa. Der Beitrag geht in einem ersten Schritt der Frage nach, wie diese Regulierungs- und Kontrolldefizite eines europäisierten Pflegemarktes von den Agenturen und ihren politischen Verbänden (aus-)genutzt und gefüllt werden. In einem zweiten Schritt werden die Implikationen von Vermarktlichung und Europäisierung auf der Ebene der Nutzer*innen analysiert. Präsentiert werden Ergebnisse aus einer qualitativen Studie mit Familien Pflegebedürftiger, die Kund*innen der Vermittlungsagenturen sind.   Between Marketization and Europeanization: The Growing Importance of Transnationally Acting Agencies for Domestic Care Work in Germany This article looks at recent developments in the field of transnational care migration, analysing the interacting processes of marketisation and Europeanisation. We argue that as a result of regulation and control gaps within the EU multilevel system, a burgeoning business sector has emerged, facilitating the establishment of new actors: posting and brokering agencies for live-in care workers from Central and Eastern Europe. First, we address the question of how these regulation and control gaps within a Europeanised care market are being (mis)used by agencies and their political associations. Second, we analyse the implications of marketisation and Europeanisation on the level of the users (households). The analysis is based on results from a qualitative study with families employing an agency brokered transnational care worker. JEL-Klassifizierung: I13

Advantages and challenges of phenotypic screens: The identification of two novel antifungal geranylgeranyltransferase I inhibitors

Phenotypic screens are still the most effective starting points for compounds with desirable activities. To identify novel antifungal leads we have conducted a phenotypic screen in the yeast Saccharomyces cerevisiae and identified two different scaffolds with good growth inhibitory characteristics. Lack of broad spectrum antifungal activity against pathogenic fungi raised the question about the modulated target as required for directed chemical compound optimization. Chemogenomic profiling identified effects on geranylgeranyltransferase I (GGTase I), an enzyme that prenylates proteins involved in cell signaling like Cdc42p and Rho1p. Raising resistant mutants against both compounds confirmed the target hypothesis and allowed mapping of the compound binding site to the substrate binding pocket. Differential resistance conferring mutations and substrate competition for only one chemotype demonstrated a diverse binding mode for the two chemotypes. Exchange of the S.cerevisiae GGTase I complex by that of Candida albicans abolished growth inhibitory activity of both compounds thus confirming the identified target as well as the observed narrow antifungal spectrum. Reported lack of essentiality of this prenylation pathway in pathogenic species challenges the therapeutic value of these leads and demonstrates the importance of an integrated target identification platform following a phenotypic screen

Direct Interaction of Chivosazole F with Actin Elicits Cell Responses Similar to Latrunculin A but Distinct from Chondramide

The microbial metabolite Chivosazole F has been described to affect the cytoskeleton and to inhibit actin polymerization <i>in vitro</i>. Applying orthogonal genomic and proteomics approaches, we now show for the first time that Chivosazole F exerts its effect by directly interacting with actin and demonstrate the cellular impact of Chivosazole F in an unbiased, genome-wide context in yeast and in mammalian cells. Furthermore, mutation-based resistance mapping identifies two SNPs located in the putative Chivosazole F binding site of actin. Comparing chemogenomic profiles and responses to the Chivosazole F-resistant SNPs shows a partially conserved mechanism of action for Chivosazole F and Latrunculin A, but clear divergence from Chondramide. In addition, C14orf80 is an evolutionarily highly conserved ORF, lacking any functional annotation. As editing of C14orf80 leads to Chivosazole F hyper-resistance, we propose a function for this gene product in counteracting perturbation of actin filaments

Direct Interaction of Chivosazole F with Actin Elicits Cell Responses Similar to Latrunculin A but Distinct from Chondramide

The microbial metabolite Chivosazole F has been described to affect the cytoskeleton and to inhibit actin polymerization <i>in vitro</i>. Applying orthogonal genomic and proteomics approaches, we now show for the first time that Chivosazole F exerts its effect by directly interacting with actin and demonstrate the cellular impact of Chivosazole F in an unbiased, genome-wide context in yeast and in mammalian cells. Furthermore, mutation-based resistance mapping identifies two SNPs located in the putative Chivosazole F binding site of actin. Comparing chemogenomic profiles and responses to the Chivosazole F-resistant SNPs shows a partially conserved mechanism of action for Chivosazole F and Latrunculin A, but clear divergence from Chondramide. In addition, C14orf80 is an evolutionarily highly conserved ORF, lacking any functional annotation. As editing of C14orf80 leads to Chivosazole F hyper-resistance, we propose a function for this gene product in counteracting perturbation of actin filaments

Direct Interaction of Chivosazole F with Actin Elicits Cell Responses Similar to Latrunculin A but Distinct from Chondramide

The microbial metabolite Chivosazole F has been described to affect the cytoskeleton and to inhibit actin polymerization <i>in vitro</i>. Applying orthogonal genomic and proteomics approaches, we now show for the first time that Chivosazole F exerts its effect by directly interacting with actin and demonstrate the cellular impact of Chivosazole F in an unbiased, genome-wide context in yeast and in mammalian cells. Furthermore, mutation-based resistance mapping identifies two SNPs located in the putative Chivosazole F binding site of actin. Comparing chemogenomic profiles and responses to the Chivosazole F-resistant SNPs shows a partially conserved mechanism of action for Chivosazole F and Latrunculin A, but clear divergence from Chondramide. In addition, C14orf80 is an evolutionarily highly conserved ORF, lacking any functional annotation. As editing of C14orf80 leads to Chivosazole F hyper-resistance, we propose a function for this gene product in counteracting perturbation of actin filaments

Direct Interaction of Chivosazole F with Actin Elicits Cell Responses Similar to Latrunculin A but Distinct from Chondramide

The microbial metabolite Chivosazole F has been described to affect the cytoskeleton and to inhibit actin polymerization <i>in vitro</i>. Applying orthogonal genomic and proteomics approaches, we now show for the first time that Chivosazole F exerts its effect by directly interacting with actin and demonstrate the cellular impact of Chivosazole F in an unbiased, genome-wide context in yeast and in mammalian cells. Furthermore, mutation-based resistance mapping identifies two SNPs located in the putative Chivosazole F binding site of actin. Comparing chemogenomic profiles and responses to the Chivosazole F-resistant SNPs shows a partially conserved mechanism of action for Chivosazole F and Latrunculin A, but clear divergence from Chondramide. In addition, C14orf80 is an evolutionarily highly conserved ORF, lacking any functional annotation. As editing of C14orf80 leads to Chivosazole F hyper-resistance, we propose a function for this gene product in counteracting perturbation of actin filaments